昆布多糖硫酸酯的抑制血管生成和抗肿瘤作用
作者：徐中平 李福川 王海仁
单位：山东大学生命科学院 济南 250100
关键词：昆布多糖硫酸酯；制备；血管生成抑制 抗肿瘤
中草药990736 摘 要 昆布多糖硫酸酯是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)附着和bFGF依赖性细胞增殖的抑制剂，能够抑制内皮细胞形成管状结构，抑制鸡绒毛膜尿囊膜的形成，并具有抗鼠RIF-1肿瘤生长活性。
昆布多糖(laminarin) 又称褐藻淀粉，是一种广泛存在于褐藻中的中性葡聚糖，尤其在昆布属、海带属等植物体中含量丰富。据范曼芳[1]报道，从海带Laminaria japonica Aresch.制取昆布多糖，得率可达1%(相对于海带干重)。昆布多糖在人工条件下可硫酸化为昆布多糖硫酸酯(laminarin sulphate,LAMS)，它具有多方面的生物活性，笔者主要综述LAMS在抗血管生成和抗肿瘤两个方面的研究进展。
, http://www.100md.com
1 LAMS的制备
纯净的昆布多糖用溶于N，N-二甲基甲酰胺的SO3吡啶复合物作为硫酸化试剂，80℃作用数小时，可得到一系列不同硫酸化程度(每单糖残基上的硫酸基团数 ds)的LAMS[2]。昆布多糖是葡萄糖残基以β-1，3糖苷键构成的长链为主链，在主链上约有10%的以β-1，6糖苷键与主链构成的分支，分支聚合度平均为35[3]。昆布多糖硫酸化后，其主链的基本结构几乎没有发生降解，只是不同程度的在葡萄糖残基的2，4，6位碳原子上增添了硫酸基团，6位碳被硫酸化的机率可能较高，2，4位碳依次降低[2]。
2 LAMS的抗血管生成作用
2.1 对bFGF及其依赖性细胞增殖的影响：LAMS是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)附着的拮抗剂和bFGF依赖性细胞增殖的抑制剂。Holffman[4]发现LAMS的硫酸化程度越高，对bFGF的抑制作用越强，ds为2.31的LAMS可使bFGF依赖性胎牛心内皮(FBHE)细胞对bFGF的空载率达67%。同样，随着硫酸化程度的升高，LAMS对bFGF所诱导的FBHE细胞的DNA合成的抑制作用增强，细胞增殖也受到抑制。但培养基中如果同时加入1 μg/mL的bFGF，这一抑制作用却消失，提示bFGF的拮抗机制参与了这一复合物的抗增殖作用。LAMS可能对与bFGF依赖性细胞增殖有关的疾病有疗效。
, 百拇医药
幼龄仓鼠肾成纤维(BHK)细胞表面具有对bFGF亲和力不同的两种位点，LAMS均能抑制bFGF与这两种位点结合，但更强烈的作用于低亲和位点。LAMS可以将bFGF从低亲和位点上解离下来，对高亲和位点上的bFGF却不能。将bFGF进行电泳，加入LAMS，bFGF的电泳迁移率增加，这说明LAMS可以直接与bFGF结合[4]。
LAMS与肝素均为多硫酸化复合物，LAMS能够模拟肝素的一些生物活性。肝素及肝素类似物除了具有抗凝血作用外，还对细胞增殖和小血管生成(neovascularizaton)具有调节作用。LAMS也具有一定的抗凝作用，并对脑血管系统疾病有预防和治疗效果。Miao[5]等发现LAMS以与肝素相似的作用方式抑制bFGF与皮下的细胞外基质(ECM)和血管平滑肌细胞表面受体的结合，在1 μg/mL的低浓度下，LAMS可以有效地将与ECM和细胞表面受体结合的bFGF解离下来，并有效地抑制血管平滑肌细胞的增殖。
, 百拇医药
由此可见，LAMS抑制bFGF依赖性细胞增殖的机制在于使bFGF不能与其亲和位点结合，干扰其信号刺激作用。
2.2 抗血管生成作用：LAMS能抑制培养于基质膜材料-Matrigel上的内皮细胞形成管状结构。人微血管内皮HMEC-1细胞培养于Matrigel上1～2 h，细胞进行迁移；8～12 h，可以形成管状网络结构。LAMS可以抑制这一管状结构的形成，并且具有剂量依赖关系。培养基中加入3 μg/mL LAMS，可以阻止HMEC-1细胞形成具有完整网络的管状结构，加入30 μg/mL LAMS，HMEC-1细胞则不能形成管状结构，尽管细胞能够迁移，形成细胞团，用FBHE细胞作为细胞模型也获得了同样的结果[3]。
用鸡绒毛膜尿囊膜(CAM)测定法来研究由肿瘤诱导的血管生成是Folkman[6]于1975年最先建立的，现在已广泛应用于血管抑制剂的研究。将含10 μg LAMS的小丸(pellet)植入鸡胚，可以抑制80%的鸡胚的CAM形成，将含50 μg LAMS的小丸植入鸡胚，几乎所有的鸡胚不能形成CAM，但这个剂量却造成40%的鸡胚死亡。苏拉明是一种血管抑制剂[7]，用苏拉明作阳性对照(50 μg/pellet)，CAM的形成抑制率为35%，12%的鸡胚死亡。显然LAMS的血管抑制活性明显高于苏拉明，但毒副作用更大。
, 百拇医药
3 LAMS的体内、外抗肿瘤作用
体内、外实验证实，LAMS具有抗肿瘤作用[3]。由于LAMS在结构上与肝素相似，小鼠腹腔给药易引起出血性死亡，而静脉给药具有良好的耐受性。对于ds为2.31的LAMS最大血浆耐受浓度为9.5 μg/mL，体内最大给药剂量为13 mg/kg。
小鼠皮下接种RIF-1肿瘤细胞，LAMS单独给药，使肿瘤生长延迟2.6 d(P<0.01)。Folkman[8]发现肝素与皮质类甾醇物质四氢皮质甾醇(THC)联用，具有抗血管生成和抗肿瘤活性，后来Tanaka[9]证实类肝素的一些抗血管生成物质的抗肿瘤活性可被皮质甾醇类物质所加强。LAMS与THC联用，使RIF-1肿瘤生长延迟4.8 d(P<0.01)，而且处理组小鼠均未表现出任何的体重下降和其它的毒副作用。
Teicher[10]发现血管抑制剂可以加强一些细胞毒物质的抗肿瘤活性。苯丙氨酸氮芥(iv 5 mg/kg)与LAMS联用，可使RIF-1肿瘤生长延迟6.1 d(P<0.01)，而单独使用苯丙氨酸氮芥，仅能使PIF-1肿瘤生长延迟2.2 d。
, 百拇医药
体外，LAMS也具有抑制培养的RIF-1肿瘤细胞增殖作用，IC50为30 μg/mL。
4 小结与展望
现已发现，当肿瘤组织大于2 mm时，需要新生血管为其生长继续提供充足的氧和营养物质，新血管生成是肿瘤组织迅速生长和转移的重要条件之一[11]，因此抑制肿瘤组织的血管生成是肿瘤治疗的新战略和新途径[12]。由于本文所提及的关于LAMS抗血管生成作用都是以非转化的细胞为模型来进行研究的，还不能认为肿瘤组织中的血管生成抑制如同体外模型一样，但从这些模型所得的认识，可以使我们获得关于肿瘤的血管生成抑制的某些启示。bFGF是一种强力的血管生成刺激因子，并且高水平的存在于肿瘤患者的尿液中[13]。现已证实戊聚糖多硫酸酯(PPS)[14]、壳聚糖衍生物[15]、Bacteria-derived DS-4152[16]等这些具有抗肿瘤活性的多硫酸化的多糖物质对与肝素结合的由肿瘤组织产生的bFGF具有抑制作用。因此有理由推测LAMS能够干扰肿瘤组织中的bFGF的血管生成信号刺激作用，使肿瘤组织的血管生成受阻，肿瘤生长受到抑制。另外，LAMS还是一种免疫激活剂，能够对抗化疗药物环磷酰胺引起的白细胞减少，具有升高白细胞作用[1]。由此看来，LAMS及其类似物极有希望成为一类新的效果良好而无明显毒副作用的抗癌药物。
, 百拇医药
根据O'Reilly提出的新的癌灶转移假说[17]，原发性癌灶可产生刺激和抑制血管生成相互拮抗的两种因子，在原发灶，刺激因子的量大于抑制因子，原发灶生长迅速，但抑制因子的半衰期比刺激因子长，以致于抑制因子到达转移灶的量大于刺激因子，从而抑制转移灶的生长。当原发灶被切除时，由于转移灶血管生成的抑制因子来源消失，所以转移灶生长加快。后来，从移植Lewis肺癌的小鼠血清和尿液中分离到了38 kD的血管生成抑制素(angiostatin)有力地支持了这一假说。临床上也经常发现肿瘤术后易复发、病情进一步恶化现象，这一假说如成立，不难推测，LAMS由于是一种血管生成抑制剂，极有可能使肿瘤组织中的血管生成刺激因素减少或者使抑制血管生成的因素增加，从而改变肿瘤组织中原有的刺激和抑制血管生成因素对比，使之向抑制血管生成的趋势转化，使肿瘤的血管生成和肿瘤生长都受到抑制。如果这种推测成立的话，LAMS不失为一种配合手术治疗肿瘤的有效药物。
参考文献
, 百拇医药 1 范曼芳，等.中国药科大学学报，1988，10(1)：30
2 Alban S,et al.Arzneim-Forsch,1992,42(8):1005
3 Holffman R,et al.B J Cancer,1996,73(10):1183
4 Holffman R,et al.J Cell Sci,1995,108(pt II):3591
5 Miao H Q,et al.J Cell Physiol,1995,164(3):482
6 Folkman J,et al.Adv Cancer Res,1975,43:175
7 Peseti E,et al.Brit J Cangcer,1992,66:367
, 百拇医药
8 Folkman J,et al.Science,1983,221:719
9 Tanaka Ng,et al.Cancer Res,1989,49:6727
10 Teicher Ba,et al.Cancer Res,1992,52:6702
11 Folfman J,et al.Natl Cancer Inst,1994,82:4
12 Scott Pae,et al.Cancer Treat Res,1994,20:393
13 Nguyen M,et al.J Natl Cancer Inst,1994,82:356
14 Zugmaier G,et al.J Natl Cancer Inst,1992,84:1716
15 Murata J,et al.Cancer Res,1991,51:22
16 Nakayama Y,et al.J Cell Physiol,1993,154:1
17 盛 节，等.生命的化学，1998，18(4)：3
收稿日期：1999-02-01, http://www.100md.com
单位：山东大学生命科学院 济南 250100
关键词：昆布多糖硫酸酯；制备；血管生成抑制 抗肿瘤
中草药990736 摘 要 昆布多糖硫酸酯是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)附着和bFGF依赖性细胞增殖的抑制剂，能够抑制内皮细胞形成管状结构，抑制鸡绒毛膜尿囊膜的形成，并具有抗鼠RIF-1肿瘤生长活性。
昆布多糖(laminarin) 又称褐藻淀粉，是一种广泛存在于褐藻中的中性葡聚糖，尤其在昆布属、海带属等植物体中含量丰富。据范曼芳[1]报道，从海带Laminaria japonica Aresch.制取昆布多糖，得率可达1%(相对于海带干重)。昆布多糖在人工条件下可硫酸化为昆布多糖硫酸酯(laminarin sulphate,LAMS)，它具有多方面的生物活性，笔者主要综述LAMS在抗血管生成和抗肿瘤两个方面的研究进展。
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1 LAMS的制备
纯净的昆布多糖用溶于N，N-二甲基甲酰胺的SO3吡啶复合物作为硫酸化试剂，80℃作用数小时，可得到一系列不同硫酸化程度(每单糖残基上的硫酸基团数 ds)的LAMS[2]。昆布多糖是葡萄糖残基以β-1，3糖苷键构成的长链为主链，在主链上约有10%的以β-1，6糖苷键与主链构成的分支，分支聚合度平均为35[3]。昆布多糖硫酸化后，其主链的基本结构几乎没有发生降解，只是不同程度的在葡萄糖残基的2，4，6位碳原子上增添了硫酸基团，6位碳被硫酸化的机率可能较高，2，4位碳依次降低[2]。
2 LAMS的抗血管生成作用
2.1 对bFGF及其依赖性细胞增殖的影响：LAMS是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)附着的拮抗剂和bFGF依赖性细胞增殖的抑制剂。Holffman[4]发现LAMS的硫酸化程度越高，对bFGF的抑制作用越强，ds为2.31的LAMS可使bFGF依赖性胎牛心内皮(FBHE)细胞对bFGF的空载率达67%。同样，随着硫酸化程度的升高，LAMS对bFGF所诱导的FBHE细胞的DNA合成的抑制作用增强，细胞增殖也受到抑制。但培养基中如果同时加入1 μg/mL的bFGF，这一抑制作用却消失，提示bFGF的拮抗机制参与了这一复合物的抗增殖作用。LAMS可能对与bFGF依赖性细胞增殖有关的疾病有疗效。
, 百拇医药
幼龄仓鼠肾成纤维(BHK)细胞表面具有对bFGF亲和力不同的两种位点，LAMS均能抑制bFGF与这两种位点结合，但更强烈的作用于低亲和位点。LAMS可以将bFGF从低亲和位点上解离下来，对高亲和位点上的bFGF却不能。将bFGF进行电泳，加入LAMS，bFGF的电泳迁移率增加，这说明LAMS可以直接与bFGF结合[4]。
LAMS与肝素均为多硫酸化复合物，LAMS能够模拟肝素的一些生物活性。肝素及肝素类似物除了具有抗凝血作用外，还对细胞增殖和小血管生成(neovascularizaton)具有调节作用。LAMS也具有一定的抗凝作用，并对脑血管系统疾病有预防和治疗效果。Miao[5]等发现LAMS以与肝素相似的作用方式抑制bFGF与皮下的细胞外基质(ECM)和血管平滑肌细胞表面受体的结合，在1 μg/mL的低浓度下，LAMS可以有效地将与ECM和细胞表面受体结合的bFGF解离下来，并有效地抑制血管平滑肌细胞的增殖。
, 百拇医药
由此可见，LAMS抑制bFGF依赖性细胞增殖的机制在于使bFGF不能与其亲和位点结合，干扰其信号刺激作用。
2.2 抗血管生成作用：LAMS能抑制培养于基质膜材料-Matrigel上的内皮细胞形成管状结构。人微血管内皮HMEC-1细胞培养于Matrigel上1～2 h，细胞进行迁移；8～12 h，可以形成管状网络结构。LAMS可以抑制这一管状结构的形成，并且具有剂量依赖关系。培养基中加入3 μg/mL LAMS，可以阻止HMEC-1细胞形成具有完整网络的管状结构，加入30 μg/mL LAMS，HMEC-1细胞则不能形成管状结构，尽管细胞能够迁移，形成细胞团，用FBHE细胞作为细胞模型也获得了同样的结果[3]。
用鸡绒毛膜尿囊膜(CAM)测定法来研究由肿瘤诱导的血管生成是Folkman[6]于1975年最先建立的，现在已广泛应用于血管抑制剂的研究。将含10 μg LAMS的小丸(pellet)植入鸡胚，可以抑制80%的鸡胚的CAM形成，将含50 μg LAMS的小丸植入鸡胚，几乎所有的鸡胚不能形成CAM，但这个剂量却造成40%的鸡胚死亡。苏拉明是一种血管抑制剂[7]，用苏拉明作阳性对照(50 μg/pellet)，CAM的形成抑制率为35%，12%的鸡胚死亡。显然LAMS的血管抑制活性明显高于苏拉明，但毒副作用更大。
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3 LAMS的体内、外抗肿瘤作用
体内、外实验证实，LAMS具有抗肿瘤作用[3]。由于LAMS在结构上与肝素相似，小鼠腹腔给药易引起出血性死亡，而静脉给药具有良好的耐受性。对于ds为2.31的LAMS最大血浆耐受浓度为9.5 μg/mL，体内最大给药剂量为13 mg/kg。
小鼠皮下接种RIF-1肿瘤细胞，LAMS单独给药，使肿瘤生长延迟2.6 d(P<0.01)。Folkman[8]发现肝素与皮质类甾醇物质四氢皮质甾醇(THC)联用，具有抗血管生成和抗肿瘤活性，后来Tanaka[9]证实类肝素的一些抗血管生成物质的抗肿瘤活性可被皮质甾醇类物质所加强。LAMS与THC联用，使RIF-1肿瘤生长延迟4.8 d(P<0.01)，而且处理组小鼠均未表现出任何的体重下降和其它的毒副作用。
Teicher[10]发现血管抑制剂可以加强一些细胞毒物质的抗肿瘤活性。苯丙氨酸氮芥(iv 5 mg/kg)与LAMS联用，可使RIF-1肿瘤生长延迟6.1 d(P<0.01)，而单独使用苯丙氨酸氮芥，仅能使PIF-1肿瘤生长延迟2.2 d。
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体外，LAMS也具有抑制培养的RIF-1肿瘤细胞增殖作用，IC50为30 μg/mL。
4 小结与展望
现已发现，当肿瘤组织大于2 mm时，需要新生血管为其生长继续提供充足的氧和营养物质，新血管生成是肿瘤组织迅速生长和转移的重要条件之一[11]，因此抑制肿瘤组织的血管生成是肿瘤治疗的新战略和新途径[12]。由于本文所提及的关于LAMS抗血管生成作用都是以非转化的细胞为模型来进行研究的，还不能认为肿瘤组织中的血管生成抑制如同体外模型一样，但从这些模型所得的认识，可以使我们获得关于肿瘤的血管生成抑制的某些启示。bFGF是一种强力的血管生成刺激因子，并且高水平的存在于肿瘤患者的尿液中[13]。现已证实戊聚糖多硫酸酯(PPS)[14]、壳聚糖衍生物[15]、Bacteria-derived DS-4152[16]等这些具有抗肿瘤活性的多硫酸化的多糖物质对与肝素结合的由肿瘤组织产生的bFGF具有抑制作用。因此有理由推测LAMS能够干扰肿瘤组织中的bFGF的血管生成信号刺激作用，使肿瘤组织的血管生成受阻，肿瘤生长受到抑制。另外，LAMS还是一种免疫激活剂，能够对抗化疗药物环磷酰胺引起的白细胞减少，具有升高白细胞作用[1]。由此看来，LAMS及其类似物极有希望成为一类新的效果良好而无明显毒副作用的抗癌药物。
, 百拇医药
根据O'Reilly提出的新的癌灶转移假说[17]，原发性癌灶可产生刺激和抑制血管生成相互拮抗的两种因子，在原发灶，刺激因子的量大于抑制因子，原发灶生长迅速，但抑制因子的半衰期比刺激因子长，以致于抑制因子到达转移灶的量大于刺激因子，从而抑制转移灶的生长。当原发灶被切除时，由于转移灶血管生成的抑制因子来源消失，所以转移灶生长加快。后来，从移植Lewis肺癌的小鼠血清和尿液中分离到了38 kD的血管生成抑制素(angiostatin)有力地支持了这一假说。临床上也经常发现肿瘤术后易复发、病情进一步恶化现象，这一假说如成立，不难推测，LAMS由于是一种血管生成抑制剂，极有可能使肿瘤组织中的血管生成刺激因素减少或者使抑制血管生成的因素增加，从而改变肿瘤组织中原有的刺激和抑制血管生成因素对比，使之向抑制血管生成的趋势转化，使肿瘤的血管生成和肿瘤生长都受到抑制。如果这种推测成立的话，LAMS不失为一种配合手术治疗肿瘤的有效药物。
参考文献
, 百拇医药 1 范曼芳，等.中国药科大学学报，1988，10(1)：30
2 Alban S,et al.Arzneim-Forsch,1992,42(8):1005
3 Holffman R,et al.B J Cancer,1996,73(10):1183
4 Holffman R,et al.J Cell Sci,1995,108(pt II):3591
5 Miao H Q,et al.J Cell Physiol,1995,164(3):482
6 Folkman J,et al.Adv Cancer Res,1975,43:175
7 Peseti E,et al.Brit J Cangcer,1992,66:367
, 百拇医药
8 Folkman J,et al.Science,1983,221:719
9 Tanaka Ng,et al.Cancer Res,1989,49:6727
10 Teicher Ba,et al.Cancer Res,1992,52:6702
11 Folfman J,et al.Natl Cancer Inst,1994,82:4
12 Scott Pae,et al.Cancer Treat Res,1994,20:393
13 Nguyen M,et al.J Natl Cancer Inst,1994,82:356
14 Zugmaier G,et al.J Natl Cancer Inst,1992,84:1716
15 Murata J,et al.Cancer Res,1991,51:22
16 Nakayama Y,et al.J Cell Physiol,1993,154:1
17 盛 节，等.生命的化学，1998，18(4)：3
收稿日期：1999-02-01, http://www.100md.com
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