细胞培养三种染色法检测沙眼衣原体
作者：吴中明 彭理年 刘祖林 张蕾青 肖瑜 周安 文华
单位：遵义医学院微生物学教研室
关键词：沙眼衣原体；细胞培养；免疫荧光法；Giemsa染色法；碘染法；贮存温度
临床检验杂志990516 摘要 用细胞培养法对160例有淫乱史病人标本进行沙眼衣原体培养，后经免疫荧光法，Giemsa染色法和碘染法鉴定，结果表明，免疫荧光法的敏感度最高(48/160,30.0%)，Giemsa法次之(43/160，26.9%)，碘染色法较低(39/160，24.4%)，但后两者简便快速，可以节省昂贵的试剂购置费用，仍是有待发展的检测技术；沙眼衣原体标本贮存以液氮最佳，在7天内，-70°C是一个临界分离温度。
Detection of chlamydia trachomatis infection by three staining methods of cell culture
, http://www.100md.com
WU Zhongming,PENG Linian,LIU Zuling,ZHANG Leiqin,XIAO Yu,ZHOU An,WEN Hua(Zunyi Medical College,Zunyi 563003)
Abstract To evaluate three staining methods of cell culture for detection of chlamydia trachomatis in 160 clinical specimens from patients in a sexually transmitted disease.These results showed that positive rate of detection with monoclonal antibody immunofluorescent technique,Giemsa staining and iodine staining were 30.0%，26.9% and 24.4% respectively.Of the two the latters possessed simple,cheap and rapid.Positive rate decrease 6.7% when specimen stored at -70°C.
, 百拇医药
Key words Chlamydia trachomatis； Cell culture； Immunofluorescent technique; Giemsa stain; Iodine stain; Storage temperature
细胞培养法培养沙眼衣原体，结果稳定、可靠，是WHO推荐的主要方法之一[1]。研究沙眼衣原体的细胞培养法及其影响因素，将有助于提高这种病原体的检出率和临床诊治水平。
1 材料和方法
1.1 标本 取自我院门诊和住院的160例有性乱史病人，其中男患者105例，女患者55例，年龄16～50(岁)。采集标本前，先以消毒棉球擦去取材局部的粘液，再用消毒棉拭子插入男性尿道3 cm～4 cm，或女性宫颈2 cm～3 cm，旋转3～5次收集上皮细胞，然后将棉拭子放入有2颗玻璃珠子、含0.2 mol/L蔗糖磷酸缓冲液1.0 ml的Eppendof管中，挤压震荡10 s～15 s后弃去拭子，迅速送实验室进行细胞接种。
, http://www.100md.com
1.2 细胞培养法 参考文献[2]取McCoy细胞，用RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清、200 mmol/L L-谷氨酰胺、庆大霉素20 μg/ml、两性霉素5 μg/ml)配成3.5×105/ml细胞悬液，按每孔0.2 ml加入96孔培养板，放37°C 5% CO2孵箱内培养，细胞长成单层即可接种样品。每孔加入样品液0.1 ml，每份样品加6孔，室温下3 000 r/min 离心30 min，然后放37°C静置20 min，吸出培养液，每孔补加0.2 ml沙眼衣原体生长液(含放线菌酮0.5 μg/ml、万古霉素25 μg/ml)，用预试3种染色法均为阳性的标本作为阳性对照，不加样品的细胞为阴性对照，置37°C培养48 h～72 h，吸干孔内液体，冷丙酮固定后分别用下列方法检测。
1.2.1 碘染色法 用Lugol碘液染5 min，高倍镜下观察，细胞浆内有3个以上红褐色或暗褐色的糖原块出现时，报告阳性。
, 百拇医药
1.2.2 Giemsa染色法 用Giemsa应用液染色30 min，吸出染液，在95%乙醇中快速过1次，除去多余的染料，干后油镜观察，在灰色的细胞浆和粉红色的细胞核衬托下，衣原体原体为紫色致密颗粒，始体近于兰色、较大而疏松，形成的包涵体可呈桑椹形、帽形或将细胞核挤在一边的填塞形。
1.2.3 免疫荧光法 用Micro Trak沙眼衣原体荧光素标记单抗(美国Syva公司)检查，荧光显微镜下观察，细胞内有3个以上苹果绿色的荧光颗粒者判作阳性。
经以上方法检查，均为阴性的样品，盲传一次后，再复核。
1.3 不同的环境温度对沙眼衣原体活力的影响 取上述3种方法检查均为阳性的样品培养液15份，分别存放在37°C、4°C、-10°C、-70°C和液氮中，定期取出，用碘染色法检查培养细胞样品的阳性数。
2 结果
, 百拇医药
2.1 3种染色法检测结果见表1。
表1 细胞培养法3种染色检测结果(n=160)
Table 1 The results of stained by using three staining methods of cell culture of specimens from 160 patients
methods
positive
negative
χ2
P
initially
, http://www.100md.com
after passage
Iodine staining
Giemsa staining
Immunofluoresant technique
30
33
39
9
10
9
121
117
, 百拇医药
112
31.49
<0.005
结果显示，免疫荧光法、Giemsa染色法和碘染色法的阳性率分别为30.0%、26.9%和24.4%，三种检测法之间差别有高度显著性(P<0.005)。
2.2 标本的贮存温度对检出结果的影响(表2)。
表2 15份阳性样品经不同温度贮存后检出情况
Table 2 Effect of storage at different temperatures on the viability of chlamydia trachomatis from 15 positive specimens
, http://www.100md.com
Temp
days of storage
1
2
3
4
5
6
7
8
4°C
37°C
-10°C
, http://www.100md.com
-70°C
Liq N2
14
5
14
9
0
13
15
8
0
10
6
, 百拇医药
8
4
4
14
2
0
13
15
3 讨论
临床上沙眼衣原体感染的病原学诊断，必须依靠实验室检查。虽然标本的直接涂片，可以检出部分样品的沙眼衣原体，但漏诊率较高。沙眼衣原体的细胞培养法敏感性约为80%～90%，极少有假阳性，是目前确诊衣原体感染的最可靠方法[3]。本研究用McCoy细胞培养临床标本后，再以3种染色法检测，其敏感度依次为，单抗免疫荧光法，Giemsa染色法及碘染色法。沙眼衣原体感染的初次培养有一定的漏诊率，在我们的研究里，首次阴性盲传一次后转为阳性者，占全部阳性病例的19.1%～27.0%，与王启操等报道相似[5]，提示对初次培养阴性者进行盲传复检十分必要。
, 百拇医药
沙眼衣原体培养成功与否，标本的贮存温度及检测时间是关键之一。既往沙眼衣原体毒株有置-40°C温冰箱保存的报道[5]，我们将15份阳性标本分别贮存于4°C、37°C、-10°C、-70°C和液氮中，结果显示，标本中衣原体的活力随贮存温度的升高和时间的延长而明显下降，即使在-70°C的条件下，标本的阳性率在7天内亦下降6.7%，但低于James等[6]报道的11%～20%。液氮可以长期保存标本，但费用高耗。目前，在-70°C超低温冰箱和液氮供给仍难以普及的情况下，临床标本采集后，应尽快进行细胞接种，以确保检测的准确性。
参考文献
1 WHO.STD case management workbook,module one,The transmission and control of STD/HIV(Field test version)，1994.9
, 百拇医药
2 Kluytmans J A J W,Goessens W H F G，Mouton J W,et al.Evaluation of clearview and magic lite tests,polymerase chain reaction,and cell culture for detection of chlamydia trachomatis in urogenital specimens.J Clin Microbiol,1993，31:3204
3 Setness P A.Chlamydial infections,Gaining control of a growing epidemic,Postgrad Med,1989，36：1300
4 王启操、张国威、何之志，等，泌尿生殖道沙眼衣原体分离培养方法探讨.中华皮肤科杂志，1996，29：198
5 张力、张晓楼、金秀英，等.沙眼衣原体TE-55株在DEAE -dextran处理的Hela-299细胞中原代及传代培养.中华流行病学杂志，1989，10：170
6 James B M,Max A C.Effect of swab type and storage temperature on the isolation of chlamydia trachomatis from clinical specimens.J Clin Microbiol,1985，22：865
(1998-10-28收稿，1999-04-07修回), 百拇医药
单位：遵义医学院微生物学教研室
关键词：沙眼衣原体；细胞培养；免疫荧光法；Giemsa染色法；碘染法；贮存温度
临床检验杂志990516 摘要 用细胞培养法对160例有淫乱史病人标本进行沙眼衣原体培养，后经免疫荧光法，Giemsa染色法和碘染法鉴定，结果表明，免疫荧光法的敏感度最高(48/160,30.0%)，Giemsa法次之(43/160，26.9%)，碘染色法较低(39/160，24.4%)，但后两者简便快速，可以节省昂贵的试剂购置费用，仍是有待发展的检测技术；沙眼衣原体标本贮存以液氮最佳，在7天内，-70°C是一个临界分离温度。
Detection of chlamydia trachomatis infection by three staining methods of cell culture
, http://www.100md.com
WU Zhongming,PENG Linian,LIU Zuling,ZHANG Leiqin,XIAO Yu,ZHOU An,WEN Hua(Zunyi Medical College,Zunyi 563003)
Abstract To evaluate three staining methods of cell culture for detection of chlamydia trachomatis in 160 clinical specimens from patients in a sexually transmitted disease.These results showed that positive rate of detection with monoclonal antibody immunofluorescent technique,Giemsa staining and iodine staining were 30.0%，26.9% and 24.4% respectively.Of the two the latters possessed simple,cheap and rapid.Positive rate decrease 6.7% when specimen stored at -70°C.
, 百拇医药
Key words Chlamydia trachomatis； Cell culture； Immunofluorescent technique; Giemsa stain; Iodine stain; Storage temperature
细胞培养法培养沙眼衣原体，结果稳定、可靠，是WHO推荐的主要方法之一[1]。研究沙眼衣原体的细胞培养法及其影响因素，将有助于提高这种病原体的检出率和临床诊治水平。
1 材料和方法
1.1 标本 取自我院门诊和住院的160例有性乱史病人，其中男患者105例，女患者55例，年龄16～50(岁)。采集标本前，先以消毒棉球擦去取材局部的粘液，再用消毒棉拭子插入男性尿道3 cm～4 cm，或女性宫颈2 cm～3 cm，旋转3～5次收集上皮细胞，然后将棉拭子放入有2颗玻璃珠子、含0.2 mol/L蔗糖磷酸缓冲液1.0 ml的Eppendof管中，挤压震荡10 s～15 s后弃去拭子，迅速送实验室进行细胞接种。
, http://www.100md.com
1.2 细胞培养法 参考文献[2]取McCoy细胞，用RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清、200 mmol/L L-谷氨酰胺、庆大霉素20 μg/ml、两性霉素5 μg/ml)配成3.5×105/ml细胞悬液，按每孔0.2 ml加入96孔培养板，放37°C 5% CO2孵箱内培养，细胞长成单层即可接种样品。每孔加入样品液0.1 ml，每份样品加6孔，室温下3 000 r/min 离心30 min，然后放37°C静置20 min，吸出培养液，每孔补加0.2 ml沙眼衣原体生长液(含放线菌酮0.5 μg/ml、万古霉素25 μg/ml)，用预试3种染色法均为阳性的标本作为阳性对照，不加样品的细胞为阴性对照，置37°C培养48 h～72 h，吸干孔内液体，冷丙酮固定后分别用下列方法检测。
1.2.1 碘染色法 用Lugol碘液染5 min，高倍镜下观察，细胞浆内有3个以上红褐色或暗褐色的糖原块出现时，报告阳性。
, 百拇医药
1.2.2 Giemsa染色法 用Giemsa应用液染色30 min，吸出染液，在95%乙醇中快速过1次，除去多余的染料，干后油镜观察，在灰色的细胞浆和粉红色的细胞核衬托下，衣原体原体为紫色致密颗粒，始体近于兰色、较大而疏松，形成的包涵体可呈桑椹形、帽形或将细胞核挤在一边的填塞形。
1.2.3 免疫荧光法 用Micro Trak沙眼衣原体荧光素标记单抗(美国Syva公司)检查，荧光显微镜下观察，细胞内有3个以上苹果绿色的荧光颗粒者判作阳性。
经以上方法检查，均为阴性的样品，盲传一次后，再复核。
1.3 不同的环境温度对沙眼衣原体活力的影响 取上述3种方法检查均为阳性的样品培养液15份，分别存放在37°C、4°C、-10°C、-70°C和液氮中，定期取出，用碘染色法检查培养细胞样品的阳性数。
2 结果
, 百拇医药
2.1 3种染色法检测结果见表1。
表1 细胞培养法3种染色检测结果(n=160)
Table 1 The results of stained by using three staining methods of cell culture of specimens from 160 patients
methods
positive
negative
χ2
P
initially
, http://www.100md.com
after passage
Iodine staining
Giemsa staining
Immunofluoresant technique
30
33
39
9
10
9
121
117
, 百拇医药
112
31.49
<0.005
结果显示，免疫荧光法、Giemsa染色法和碘染色法的阳性率分别为30.0%、26.9%和24.4%，三种检测法之间差别有高度显著性(P<0.005)。
2.2 标本的贮存温度对检出结果的影响(表2)。
表2 15份阳性样品经不同温度贮存后检出情况
Table 2 Effect of storage at different temperatures on the viability of chlamydia trachomatis from 15 positive specimens
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Temp
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3 讨论
临床上沙眼衣原体感染的病原学诊断，必须依靠实验室检查。虽然标本的直接涂片，可以检出部分样品的沙眼衣原体，但漏诊率较高。沙眼衣原体的细胞培养法敏感性约为80%～90%，极少有假阳性，是目前确诊衣原体感染的最可靠方法[3]。本研究用McCoy细胞培养临床标本后，再以3种染色法检测，其敏感度依次为，单抗免疫荧光法，Giemsa染色法及碘染色法。沙眼衣原体感染的初次培养有一定的漏诊率，在我们的研究里，首次阴性盲传一次后转为阳性者，占全部阳性病例的19.1%～27.0%，与王启操等报道相似[5]，提示对初次培养阴性者进行盲传复检十分必要。
, 百拇医药
沙眼衣原体培养成功与否，标本的贮存温度及检测时间是关键之一。既往沙眼衣原体毒株有置-40°C温冰箱保存的报道[5]，我们将15份阳性标本分别贮存于4°C、37°C、-10°C、-70°C和液氮中，结果显示，标本中衣原体的活力随贮存温度的升高和时间的延长而明显下降，即使在-70°C的条件下，标本的阳性率在7天内亦下降6.7%，但低于James等[6]报道的11%～20%。液氮可以长期保存标本，但费用高耗。目前，在-70°C超低温冰箱和液氮供给仍难以普及的情况下，临床标本采集后，应尽快进行细胞接种，以确保检测的准确性。
参考文献
1 WHO.STD case management workbook,module one,The transmission and control of STD/HIV(Field test version)，1994.9
, 百拇医药
2 Kluytmans J A J W,Goessens W H F G，Mouton J W,et al.Evaluation of clearview and magic lite tests,polymerase chain reaction,and cell culture for detection of chlamydia trachomatis in urogenital specimens.J Clin Microbiol,1993，31:3204
3 Setness P A.Chlamydial infections,Gaining control of a growing epidemic,Postgrad Med,1989，36：1300
4 王启操、张国威、何之志，等，泌尿生殖道沙眼衣原体分离培养方法探讨.中华皮肤科杂志，1996，29：198
5 张力、张晓楼、金秀英，等.沙眼衣原体TE-55株在DEAE -dextran处理的Hela-299细胞中原代及传代培养.中华流行病学杂志，1989，10：170
6 James B M,Max A C.Effect of swab type and storage temperature on the isolation of chlamydia trachomatis from clinical specimens.J Clin Microbiol,1985，22：865
(1998-10-28收稿，1999-04-07修回), 百拇医药