核型多角体病毒的增殖与棉铃虫血淋巴酯酶的变化
作者：徐旭士 赵贵军 李飞 刘润忠 张友清
单位：徐旭士 李飞 南昌大学生物学系， 南昌 330047；赵贵军 中山大学生物防治国家重点实验室， 广州 510275；刘润忠 张友清 中国科学院武汉病毒研究所， 武汉 430071
关键词：棉铃虫；血淋巴；酯酶；核型多角体病毒
中国病毒学990412 The Multiplication of Nuclear Polyhedrosis Viruses and
Changes of Hemolymph Esterases in Helicoverpa armigera
Larvaes after Infection with NPV
, 百拇医药 Xu Xushi1 Zhao Guijun2 Li Fei1 Liu Runzhong3 Zhang Youqing3
1 (Department of Biology, Nanchang University. Nanchang 330047)
2 (State Key Labs for Biocontrol, Zhongshan University. Guangzhou 510275)
3 (Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica. Wuhan 430071)
Abstractselectrophoresis (PAGE) and thin-layer scanning, the esterases (EST) of the third instar larvae of the Helicoverpa armigera were investigated in quality and quantity after infection with nuclear polyhedrosis viruses (NPV). The changes in sort and content of hemolymph EST were examined at six hours postinfection and the numbers of EST bands were from more to less as develop and infective time in larvae. The varies in EST pattern between infection and control were not significant but the content of each band and the accumulation of EST were obvious. According to the changeable regularity in EST content of zymogram, the total and single content in diseased larvaes always gradually decreased with passages of infective time but in the healthy larvaes had no distinct changes. The results demonstrated that the infection with NPV could affect the EST metabolism in larvae hemolymph, and the metabolic changes may show the infective level and extent, therefore it had indicated function.
, 百拇医药
Key words Helicoverpa armigera, Hemolymph, Esterase, Nuclear polyhedrosis virus
核型多角体病毒(NPV)对同源棉铃虫有很强的毒杀作用，是重要杀虫资源。病毒感染导致宿主代谢紊乱，引起一系列生化反应的变化，可通过一定方法观察到其表征，此为病毒感染的病理生化特征。昆虫血淋巴对于病毒感染引起的全身症状具有重要作用，并影响宿主物质和能量代谢的性质与水平，反映出病毒-宿主的互作关系。本文以血淋巴酯酶同工酶(EST)为感病指标，对其感染变化进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试病毒 棉铃虫核型多角体病毒，取自湖北仙桃磷肥厂生化分厂。
1.1.2 供试昆虫 棉铃虫三龄幼虫，由该厂提供，半人工饲料饲养。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 病毒感染 剂量为2.5×103 PIBs/克饲料，一次性饲毒。
1.2.2 血淋巴电泳样品制备： 按文献[1]的方法进行。对照组选取同数量的未饲毒幼虫，同法采样。样品标示： D为感病组，C为对照组，下标为采样时间。
1.2.3 凝胶电泳 按文献[2]所述进行。7.5%分离胶，4.0%浓缩胶。初始电压12 V/cm，样品进入分离胶后为15 V/cm,上样量为6 μL。
1.2.4 电泳凝胶染色与脱色 按有关文献操作[3]，制作干板供拍照和扫描。
1.2.5 凝胶薄层扫描 岛津CS-9000线性扫描，参考波长λR=385 nm,样品波长λS=480 nm。酯酶条带数以扫描峰形数表示，条带含量以各个峰面积表征。
, 百拇医药
2 结果和分析
2.1 NPV感染棉铃虫后血淋巴酯酶同工酶的变化
三龄幼虫感染NPV后120 h内EST凝胶电泳的变化及对照见图1。电泳图谱显示，6 h健虫有10条酶带(按迁移率由高到低依次为1～10)。随发育与感染时间延长，部分酶带显示“消失/出现”变化，主要表现在前沿的8、9、10带和后滞的1、2、3带，分析认为这部分酶带对NPV感染较为敏感，其中1、2、8、10带在感染早期(6～12 hpi)即出现明显的变化，揭示EST具有特定的病毒感染的病理生化意义。而位于迁移中间的6、7酶带基本存在于感染和发育的全程，可见这二类酶为昆虫发育和病毒复制所必需，其代谢不受病毒感染的控制。结果还表明，感染组与对照组的同一电泳类型的酶带不存在迁移率的变化，提示NPV感染不影响EST的空间结构。
图1 三龄健康棉铃虫幼虫和感染同源NPV后染病幼虫血淋巴酯酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
, http://www.100md.com
D为感病组，C是健康组。
Fig.1 PAGE of the esterases in the hemolymph of the healthy third instar larvae of Helicoverpa armigera and that the infective ones after infection with NPV
D.infection, C.control (the number is the time of gathering hemolymph from the larvaes)
2.2 血淋巴EST电泳凝胶的薄层扫描
按文献[2]所述的方法将扫描峰的面积换算为酶的相对含量，有关结果与数据见图2和表1(仅保留整数)。
, http://www.100md.com 表1 血淋巴酯酶同工酶的相对含量变化(感染组|对照组)
Table 1 The changes of relative content of esterases in hemolymph (infection|control) 酶带
Bands
病 毒 感 染 时 间 (h)
Hours postinfection with nuclear polyhedrosis virus
hpi 6
12
18
36
, http://www.100md.com
48
60
72
96
120
1
80|12
9|0
0|8
10|9
0|10
0|0
0|0
, http://www.100md.com
0|0
0|0
2
0|163
82|499
0|9
472|0
437|112
0|20
0|11
0|10
0|0
3
, http://www.100md.com
1024|657
10|0
0|369
0|0
185|297
116|0
0|0
0|0
0|0
4
1459|675
920|60
134|1057
, 百拇医药
230|338
320|283
90|0
0|982
0|0
0|0
5
1600|1067
1416|741
874|606
268|987
800|0
1267|0
, 百拇医药
176|1714
0|0
0|0
6
883|604
787|92
499|0
945|2083
249|2979
717|436
135|941
354|739
, http://www.100md.com 267|576
7
615|880
76|74
45|38
18|15
650|1036
590|1753
120|478
90|446
24|354
8
120|107
, 百拇医药
0|9
11|0
0|0
0|0
131|149
0|98
0|87
0|60
9
116|108
0|0
0|66
0|18
, 百拇医药
86|0
115|0
0|0
0|0
0|0
10
390|159
125|0
0|0
0|0
58|0
40|0
10|0
, http://www.100md.com
0|0
0|0
Total
6287|4432
3425|1475
1563|2153
1943|3450
2785|4717
3066|2358
441|4224
444|1282
291|990
, 百拇医药
图2 酯酶同工酶带的薄层扫描
Fig.2 The pattern of thin-layer scanning for esterases bands of PAGE
从整个感染时间来看，病毒感染对EST的效应可分三种： 1) 感染刺激EST的表达，如1、3、4、5、10带；2)感染抑制酶的合成，具体为2、7、8、9带；3) 中间类型，6号带为此类。这种结果说明，NPV感染对昆虫血淋巴EST的影响在不同的感染时间与酶带之间均不相同，提示不同迁移类型的EST在NPV感染后的病理生化意义可能互异。各样品总的EST含量的变化规律表现为感染早期(6～12 hpi)的对照组含量低于感染组0.4～0.7倍，而感染中后期(18～120 hpi)的对照组却高于感染组1.4～9.6倍，可见NPV在感染前期对血淋巴EST的合成具有刺激作用，到中后期则严重抑制酶的表达。
*江西省自然科学基金资助项目
, 百拇医药
**现在工作单位：南京师范大学生物学系，南京 210097
参考文献
1 邓塔，蔡秀玉. 烟青虫核型多角体病毒的复制和染病后血淋巴蛋白的变化. 昆虫学报. 1993，36(4)：423～429
2 徐旭士，张超英，谢天恩. BsNPV感染油桐尺蠖及Bs484细胞的酯酶分析. 中国病毒学. 1994，9(1)：37～42
3 徐卫明，宋秋宝，姚鑫等. 小鼠胚胎组织、成体组织和胚胎癌细胞酯酶同工酶谱的比较研究. 实验生物学报. 1985，18(1)：99～103
*收稿日期：1998-06-24，修回日期：1999-02-07, 百拇医药
单位：徐旭士 李飞 南昌大学生物学系， 南昌 330047；赵贵军 中山大学生物防治国家重点实验室， 广州 510275；刘润忠 张友清 中国科学院武汉病毒研究所， 武汉 430071
关键词：棉铃虫；血淋巴；酯酶；核型多角体病毒
中国病毒学990412 The Multiplication of Nuclear Polyhedrosis Viruses and
Changes of Hemolymph Esterases in Helicoverpa armigera
Larvaes after Infection with NPV
, 百拇医药 Xu Xushi1 Zhao Guijun2 Li Fei1 Liu Runzhong3 Zhang Youqing3
1 (Department of Biology, Nanchang University. Nanchang 330047)
2 (State Key Labs for Biocontrol, Zhongshan University. Guangzhou 510275)
3 (Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica. Wuhan 430071)
Abstractselectrophoresis (PAGE) and thin-layer scanning, the esterases (EST) of the third instar larvae of the Helicoverpa armigera were investigated in quality and quantity after infection with nuclear polyhedrosis viruses (NPV). The changes in sort and content of hemolymph EST were examined at six hours postinfection and the numbers of EST bands were from more to less as develop and infective time in larvae. The varies in EST pattern between infection and control were not significant but the content of each band and the accumulation of EST were obvious. According to the changeable regularity in EST content of zymogram, the total and single content in diseased larvaes always gradually decreased with passages of infective time but in the healthy larvaes had no distinct changes. The results demonstrated that the infection with NPV could affect the EST metabolism in larvae hemolymph, and the metabolic changes may show the infective level and extent, therefore it had indicated function.
, 百拇医药
Key words Helicoverpa armigera, Hemolymph, Esterase, Nuclear polyhedrosis virus
核型多角体病毒(NPV)对同源棉铃虫有很强的毒杀作用，是重要杀虫资源。病毒感染导致宿主代谢紊乱，引起一系列生化反应的变化，可通过一定方法观察到其表征，此为病毒感染的病理生化特征。昆虫血淋巴对于病毒感染引起的全身症状具有重要作用，并影响宿主物质和能量代谢的性质与水平，反映出病毒-宿主的互作关系。本文以血淋巴酯酶同工酶(EST)为感病指标，对其感染变化进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试病毒 棉铃虫核型多角体病毒，取自湖北仙桃磷肥厂生化分厂。
1.1.2 供试昆虫 棉铃虫三龄幼虫，由该厂提供，半人工饲料饲养。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 病毒感染 剂量为2.5×103 PIBs/克饲料，一次性饲毒。
1.2.2 血淋巴电泳样品制备： 按文献[1]的方法进行。对照组选取同数量的未饲毒幼虫，同法采样。样品标示： D为感病组，C为对照组，下标为采样时间。
1.2.3 凝胶电泳 按文献[2]所述进行。7.5%分离胶，4.0%浓缩胶。初始电压12 V/cm，样品进入分离胶后为15 V/cm,上样量为6 μL。
1.2.4 电泳凝胶染色与脱色 按有关文献操作[3]，制作干板供拍照和扫描。
1.2.5 凝胶薄层扫描 岛津CS-9000线性扫描，参考波长λR=385 nm,样品波长λS=480 nm。酯酶条带数以扫描峰形数表示，条带含量以各个峰面积表征。
, 百拇医药
2 结果和分析
2.1 NPV感染棉铃虫后血淋巴酯酶同工酶的变化
三龄幼虫感染NPV后120 h内EST凝胶电泳的变化及对照见图1。电泳图谱显示，6 h健虫有10条酶带(按迁移率由高到低依次为1～10)。随发育与感染时间延长，部分酶带显示“消失/出现”变化，主要表现在前沿的8、9、10带和后滞的1、2、3带，分析认为这部分酶带对NPV感染较为敏感，其中1、2、8、10带在感染早期(6～12 hpi)即出现明显的变化，揭示EST具有特定的病毒感染的病理生化意义。而位于迁移中间的6、7酶带基本存在于感染和发育的全程，可见这二类酶为昆虫发育和病毒复制所必需，其代谢不受病毒感染的控制。结果还表明，感染组与对照组的同一电泳类型的酶带不存在迁移率的变化，提示NPV感染不影响EST的空间结构。
图1 三龄健康棉铃虫幼虫和感染同源NPV后染病幼虫血淋巴酯酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
, http://www.100md.com
D为感病组，C是健康组。
Fig.1 PAGE of the esterases in the hemolymph of the healthy third instar larvae of Helicoverpa armigera and that the infective ones after infection with NPV
D.infection, C.control (the number is the time of gathering hemolymph from the larvaes)
2.2 血淋巴EST电泳凝胶的薄层扫描
按文献[2]所述的方法将扫描峰的面积换算为酶的相对含量，有关结果与数据见图2和表1(仅保留整数)。
, http://www.100md.com 表1 血淋巴酯酶同工酶的相对含量变化(感染组|对照组)
Table 1 The changes of relative content of esterases in hemolymph (infection|control) 酶带
Bands
病 毒 感 染 时 间 (h)
Hours postinfection with nuclear polyhedrosis virus
hpi 6
12
18
36
, http://www.100md.com
48
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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Total
6287|4432
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1563|2153
1943|3450
2785|4717
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, 百拇医药
图2 酯酶同工酶带的薄层扫描
Fig.2 The pattern of thin-layer scanning for esterases bands of PAGE
从整个感染时间来看，病毒感染对EST的效应可分三种： 1) 感染刺激EST的表达，如1、3、4、5、10带；2)感染抑制酶的合成，具体为2、7、8、9带；3) 中间类型，6号带为此类。这种结果说明，NPV感染对昆虫血淋巴EST的影响在不同的感染时间与酶带之间均不相同，提示不同迁移类型的EST在NPV感染后的病理生化意义可能互异。各样品总的EST含量的变化规律表现为感染早期(6～12 hpi)的对照组含量低于感染组0.4～0.7倍，而感染中后期(18～120 hpi)的对照组却高于感染组1.4～9.6倍，可见NPV在感染前期对血淋巴EST的合成具有刺激作用，到中后期则严重抑制酶的表达。
*江西省自然科学基金资助项目
, 百拇医药
**现在工作单位：南京师范大学生物学系，南京 210097
参考文献
1 邓塔，蔡秀玉. 烟青虫核型多角体病毒的复制和染病后血淋巴蛋白的变化. 昆虫学报. 1993，36(4)：423～429
2 徐旭士，张超英，谢天恩. BsNPV感染油桐尺蠖及Bs484细胞的酯酶分析. 中国病毒学. 1994，9(1)：37～42
3 徐卫明，宋秋宝，姚鑫等. 小鼠胚胎组织、成体组织和胚胎癌细胞酯酶同工酶谱的比较研究. 实验生物学报. 1985，18(1)：99～103
*收稿日期：1998-06-24，修回日期：1999-02-07, 百拇医药