柯萨奇B组病毒在Hep-2细胞内增殖特性的研究*
作者：杨占秋 刘建军 肖 红 文 利 郭淑芳 宋婕萍
单位：杨占秋 刘建军 肖 红 文 利 郭淑芳(湖北医科大学病毒研究所，武汉430071)；宋婕萍(湖北省妇幼保健院遗传中心，武汉430060)
关键词：柯萨奇B组病毒；增殖；聚合酶链反应
中国病毒学990203
摘 要 采用IFA、RT-PCR法观察了柯萨奇B组病毒(CBV)5型在Hep-2细胞内的增殖动态。CBV感染细胞后4h可检出病毒RNA，8h可检出病毒抗原，12h可观察到细胞病变，20h可检出病毒颗粒。结果为CBV增殖特性的研究提供了新的资料，并指出PCR是监测CBV增殖的敏感方法。
Propagation Characteristics of Coxsackie B Virus in Hep-2 Cells
, http://www.100md.com
Yang Zhanqiu Song Jieping Liu Jinjun et al
(Virus Research Institute, Hubei Medical University, Wuhan 430071)
Abstract The dynamic change of coxsackie B virus (CBV) 5 type propagation was studied in Hep-2 cells by immunofluorescence assay, reverse transcription polymerase chain reaction and cytological methods. The results showed that CBV RNA could be detected at 4 hours in postinfection, viral antigen was positive at 8 hours and cytopathic effect could be found at 12 hours. The viral particles could be observed at 20 hours in postinfection. These results provided new data for observation of CBV propagation, also, it indicated that the reverse transcription polymerase chain reaction was a sensitive technique for monitoring CBV propagation.
, 百拇医药
Key words Coxsackie B virus, Propagation, Polymerase chain reaction
柯萨奇病毒属小RNA病毒科的肠道病毒属，根据其致病性不同将其分为A、B两组，其中柯萨奇B组病毒(Coxsackie B virus, CBV)包括6种血清型。CBV感染与心肌炎等多种疾病有关，但发病机制仍不清楚。为了观察CBV的增殖特性，我们用免疫荧光(IFA)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察了CBV5在Hep-2细胞内的增殖动态。
1 材料与方法
1.1 细胞与病毒 Hep-2细胞和CBV-5均为本室保存，RK-13购于中国医学科学院医药生物技术研究所。
1.2 引物 参照文献[1]设计，其序列选自CBV基因组5′非编码区，由上海细胞生物所合成，上游引物序列为5′-CCCCGGACTGAGTATCAATA-3′，下游引物序列为5′-GCAGTTAGGATTAGCCGCAT-3′。
, http://www.100md.com
1.3 病毒增殖动态观察 病毒感染细胞后4、8、12、16、20、24h，收获感染细胞，部分用IFA检查病毒抗原，部分用RT-PCR检查病毒RNA，同时观察致细胞病变作用(CPE)和感染细胞内的病毒颗粒。
1.4 IFA法 参照文献[2]，电镜检查为常规法。
1.5 病毒核酸提取 按文献[3，4]改良，采用碘化钠-异硫氰酸胍-氯仿法提取CBV RNA。即取200μL培养细胞悬液依次加入100μL6mol/L碘化钠，100μL4mol/L异硫氰酸胍，400μL氯仿/异戍醇。12000r/min离心12min后，取上清至另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，室温15min沉淀CBV RNA，再次12000r/min离心12min，弃上清，沉淀以70%乙醇洗1次后，溶于20μL无RNA酶的水中，-20℃存放备用。同法制备阴性对照模板。
1.6 cDNA合成 cDNA合成反应体积为25μL，包括50mmol/L pH8.3 Tris.HCl, 50mmol/L KCl, 10mmol/L MgCl2, 100mmol/L DTT, 0.5mmol/L鲱精DNA，0.2mmol/L dNTP, 20pmol/L下游引物，2.5u AMV逆转录酶，25u RNA酶抑制剂以及5μL模板。反应在42℃45min,然后95℃5min。
, 百拇医药
1.7 PCR扩增 取上述cDNA溶液10μL加入至总体积为50μL的反应体系中，包括20mmol/L pH8.3 Tris.HCl，20mmol/L MgCl2，25mmol/L硫酸胺，0.5mg/mL明胶，25%甲酰胺，0.2mmol/L dNTP，20pmol/L上游引物，10pmol/L下游引物，1.5u Taq DNA聚合酶。反应体系用60μL液体石腊覆盖。循环反应参数为94℃ 1min, 53℃ 1min, 72℃1.5min，循环35次，最后72℃8min。扩增产物经2%琼脂糖电泳后在紫外透射仪上观察结果。
2 结果
2.1 CBV增殖特性的观察
应用IFA、RT-PCR对CBV5接种Hep-2细胞后，对不同时间的病毒抗原和病毒RNA进行了检测，结果见表1、图1和图2。从结果可知，病毒RNA首先被检出，此后用IFA法可检测到感染细胞内的病毒抗原，光镜所见的CPE在感染后12h可见。同时，我们将CBV5接种RK-13细胞，同步观察不同时间内病毒抗原、病毒RNA、CPE均为阴性。
, http://www.100md.com
图1 CBV5感染细胞后不同时间RNA的检测
Fig. 1 The detection of CBV5 RNA in Hep-2 cells by RT-PCR Line 1:water control; Line 2 to 7:CBV RNA on 4,8,12,16,20,24 hours in postinfection; Line 8:DNA marker; Line 9:negative control;Line 10:reagent control.
图2 CBV5感染细胞后的免疫荧光检测
Fig.2 The detection of CBV5 type antigen in Hep-2 cells infected with CBV by IFA
, http://www.100md.com
Showing positive fluorescence ofvirus antigen in plasma.
表1 CBV5感染细胞不同时间CPE、CBV抗原及CBV RNA动态
Table 1 The detection of viral antigen, CPE and CBV RNA in different infection time 感染时间
Time of
infection
(h)
细胞类型 Cellular type
Hep-2
, 百拇医药
RK-13
CPE
CPE
CBV抗原
CBV antigen
CBV RNA
CBV RNA
CPE
CPE
CBV抗原
CBV antigen
CBV RNA
, 百拇医药 CBV RNA
4
-
-
+
-
-
-
8
-
+
+
-
-
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-
12
+
+
+
-
-
-
16
++
++
+
-
-
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-
20
+
-
-
-
24
+
-
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-
-
*Illustration of CPE: “-” means non-CPE; “+” means CPE of 25% cells; “++”
means CPE of 50% cells; “” means CPE of more 80% cells.
**Illustration of IFA: “-” means non-fluorescence; “+” means positive
fluorescence of 25% cells;“++” means positive fluorescence of 50% cells;“”
, 百拇医药
means positive fluorescence of 80% cells.
2.2 病毒对细胞的作用
CBV5感染细胞后12h，细胞出现CPE，细胞园缩，折光性增强，胞浆颗粒增加，部分园缩细胞从瓶壁上脱落。病毒感染细胞后20h，电镜下观察细胞出现明显的感染特征，胞浆空泡化，线粒体肿胀变性，内质网扩张，核固缩，异染色质增多并趋向核膜周围(图3A)，胞浆中可见排列不规则的病毒颗粒，园形，无囊膜，直径约20～30nm(图3B)。
图3 CBV5感染Hep-2细胞的超微结构
Fig.3 The change of ultrastructure of Hep-2 cells infected with CBV5
, 百拇医药
A. nuclear degeneration, vesicle-like change in plasma; B. viral particles in cytoplasma (Bar=80nm)
3 讨论
迄今，关于CBV的致病性研究已有较多的报道，但其致病机制仍不清楚，国内外学者对CBV与细胞相互作用的关系所知甚少。为此，我们利用细胞学、免疫学和基因检测技术从不同侧面观察了CBV5在Hep-2细胞内的增殖动态。研究发现CBV感染细胞后4h即可检测到病毒RNA。这一结果与Martin等[5]的报道一致，他们指出小RNA病毒核酸在病毒吸附细胞2.0～3.5h后开始合成。Lyeke[6]也指出小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒)RNA在病毒感染细胞后2h大量合成。我们的这一发现是符合小RNA病毒的增殖特征的。为了证明病毒感染细胞后4h的RNA是新合成的还是接种时残存的病毒RNA，我们同步检测了CBV感染非允许性细胞(RK-13)4h的RNA为阴性，这也进一步说明病毒感染细胞4h的RNA可能是新合成的。
, 百拇医药
对不同方法的比较研究发现，RT-PCR在病毒感染细胞4h后即可检测到CBV RNA，而IFA法在病毒感染后8h检测到CBV抗原，CPE则在12h出现，这表明基因检测技术在检测病毒感染方面最为敏感。
目前报道的CBV RNA提取方法主要有两种：蛋白酶K-酚-氯仿法和异硫氰酸胍-酚-氯仿法[7～9]。这两种方法提取RNA均需置-70℃ 2h或-20℃过夜沉淀RNA，所需时间长，不便于快速检测。我们根据Loparev等的报道用碘化钠提取DNA的方法[4]，结合异硫氰酸胍-酚-氯仿法，建立了碘化钠-异硫氰酸胍-氯仿法提取CBV RNA，并进行了三种提取方法的比较，结果表明三种方法制备的RNA均可用于PCR扩增，效果一致(资料未显示)。而我们的方法提取的RNA只需置室温15～
30min，且不需蛋白酶K、苯酚等试剂，说明我们的方法具有快速、价廉、安全等特点，可推广应用。
, 百拇医药
* 湖北省“八.五”重点课题资助
参考文献
[1] Severini V, Mestroni L, Falaschi A et al. Nested polymerase chain reaction for high sensitivity detection of enteroviral RNA in biological samples. J Clin Microbiol, 1993,31(5):1345～1349
[2] 杨占秋，蒋文玲，朱宝莲.单纯疱疹病毒的免疫荧光点片法及其应用.蚌埠医学院学报，1985，10(2)：175～177
[3] Chomczynski P, Sachi N. Single-step method of RNA isolation by acid ganionium thiocyanate-phenol-chloform extraction. Anal Biochem, 1987,162(2):156～159
, 百拇医药
[4] Loparev VN, Cartas MA, Monken CE et al. An efficent and simple method of DNA extraction from whole blood and cells lines to identify infectious agent. J Virol Method 1991,34(2):105～112
[5] Martin EM. Replification of small RNA virus. Br Med Bull, 1967,23(2):192～197
[6] Philipson L. Replication, transcription and translation of RNA virus. In: Lycke E et al ed. Textbook of medical virology. England: Butterworth & Co Ltd. 1981.57～63
, 百拇医药
[7] Gow JG, Behan VHM, Clements GB et al. Enteroviral RNA sequences detected by polymease chain reaction in muscle of patients with posttive fatigue syndrome. Br Med J, 1991,302(6778):692～696
[8] Weiss LM, Movahed LA, Billing ME et al. Detection of coxsackievirus B3 RNA in myocardial tissues by the polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1991, 138(2):497～503
[9] Chapman NM, Tracy S, Gauntt CJ et al. Molecular detection and identification of enteroviral using enzymatic amplification and nucleic acid hybridization. J Clin Microbiol, 1990,28(5):843～850
收稿日期：1998-02-26，修回日期：1998-07-02, 百拇医药
单位：杨占秋 刘建军 肖 红 文 利 郭淑芳(湖北医科大学病毒研究所，武汉430071)；宋婕萍(湖北省妇幼保健院遗传中心，武汉430060)
关键词：柯萨奇B组病毒；增殖；聚合酶链反应
中国病毒学990203
摘 要 采用IFA、RT-PCR法观察了柯萨奇B组病毒(CBV)5型在Hep-2细胞内的增殖动态。CBV感染细胞后4h可检出病毒RNA，8h可检出病毒抗原，12h可观察到细胞病变，20h可检出病毒颗粒。结果为CBV增殖特性的研究提供了新的资料，并指出PCR是监测CBV增殖的敏感方法。
Propagation Characteristics of Coxsackie B Virus in Hep-2 Cells
, http://www.100md.com
Yang Zhanqiu Song Jieping Liu Jinjun et al
(Virus Research Institute, Hubei Medical University, Wuhan 430071)
Abstract The dynamic change of coxsackie B virus (CBV) 5 type propagation was studied in Hep-2 cells by immunofluorescence assay, reverse transcription polymerase chain reaction and cytological methods. The results showed that CBV RNA could be detected at 4 hours in postinfection, viral antigen was positive at 8 hours and cytopathic effect could be found at 12 hours. The viral particles could be observed at 20 hours in postinfection. These results provided new data for observation of CBV propagation, also, it indicated that the reverse transcription polymerase chain reaction was a sensitive technique for monitoring CBV propagation.
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Key words Coxsackie B virus, Propagation, Polymerase chain reaction
柯萨奇病毒属小RNA病毒科的肠道病毒属，根据其致病性不同将其分为A、B两组，其中柯萨奇B组病毒(Coxsackie B virus, CBV)包括6种血清型。CBV感染与心肌炎等多种疾病有关，但发病机制仍不清楚。为了观察CBV的增殖特性，我们用免疫荧光(IFA)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察了CBV5在Hep-2细胞内的增殖动态。
1 材料与方法
1.1 细胞与病毒 Hep-2细胞和CBV-5均为本室保存，RK-13购于中国医学科学院医药生物技术研究所。
1.2 引物 参照文献[1]设计，其序列选自CBV基因组5′非编码区，由上海细胞生物所合成，上游引物序列为5′-CCCCGGACTGAGTATCAATA-3′，下游引物序列为5′-GCAGTTAGGATTAGCCGCAT-3′。
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1.3 病毒增殖动态观察 病毒感染细胞后4、8、12、16、20、24h，收获感染细胞，部分用IFA检查病毒抗原，部分用RT-PCR检查病毒RNA，同时观察致细胞病变作用(CPE)和感染细胞内的病毒颗粒。
1.4 IFA法 参照文献[2]，电镜检查为常规法。
1.5 病毒核酸提取 按文献[3，4]改良，采用碘化钠-异硫氰酸胍-氯仿法提取CBV RNA。即取200μL培养细胞悬液依次加入100μL6mol/L碘化钠，100μL4mol/L异硫氰酸胍，400μL氯仿/异戍醇。12000r/min离心12min后，取上清至另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，室温15min沉淀CBV RNA，再次12000r/min离心12min，弃上清，沉淀以70%乙醇洗1次后，溶于20μL无RNA酶的水中，-20℃存放备用。同法制备阴性对照模板。
1.6 cDNA合成 cDNA合成反应体积为25μL，包括50mmol/L pH8.3 Tris.HCl, 50mmol/L KCl, 10mmol/L MgCl2, 100mmol/L DTT, 0.5mmol/L鲱精DNA，0.2mmol/L dNTP, 20pmol/L下游引物，2.5u AMV逆转录酶，25u RNA酶抑制剂以及5μL模板。反应在42℃45min,然后95℃5min。
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1.7 PCR扩增 取上述cDNA溶液10μL加入至总体积为50μL的反应体系中，包括20mmol/L pH8.3 Tris.HCl，20mmol/L MgCl2，25mmol/L硫酸胺，0.5mg/mL明胶，25%甲酰胺，0.2mmol/L dNTP，20pmol/L上游引物，10pmol/L下游引物，1.5u Taq DNA聚合酶。反应体系用60μL液体石腊覆盖。循环反应参数为94℃ 1min, 53℃ 1min, 72℃1.5min，循环35次，最后72℃8min。扩增产物经2%琼脂糖电泳后在紫外透射仪上观察结果。
2 结果
2.1 CBV增殖特性的观察
应用IFA、RT-PCR对CBV5接种Hep-2细胞后，对不同时间的病毒抗原和病毒RNA进行了检测，结果见表1、图1和图2。从结果可知，病毒RNA首先被检出，此后用IFA法可检测到感染细胞内的病毒抗原，光镜所见的CPE在感染后12h可见。同时，我们将CBV5接种RK-13细胞，同步观察不同时间内病毒抗原、病毒RNA、CPE均为阴性。
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图1 CBV5感染细胞后不同时间RNA的检测
Fig. 1 The detection of CBV5 RNA in Hep-2 cells by RT-PCR Line 1:water control; Line 2 to 7:CBV RNA on 4,8,12,16,20,24 hours in postinfection; Line 8:DNA marker; Line 9:negative control;Line 10:reagent control.
图2 CBV5感染细胞后的免疫荧光检测
Fig.2 The detection of CBV5 type antigen in Hep-2 cells infected with CBV by IFA
, http://www.100md.com
Showing positive fluorescence ofvirus antigen in plasma.
表1 CBV5感染细胞不同时间CPE、CBV抗原及CBV RNA动态
Table 1 The detection of viral antigen, CPE and CBV RNA in different infection time 感染时间
Time of
infection
(h)
细胞类型 Cellular type
Hep-2
, 百拇医药
RK-13
CPE
CPE
CBV抗原
CBV antigen
CBV RNA
CBV RNA
CPE
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CBV抗原
CBV antigen
CBV RNA
, 百拇医药 CBV RNA
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*Illustration of CPE: “-” means non-CPE; “+” means CPE of 25% cells; “++”
means CPE of 50% cells; “
” means CPE of more 80% cells.**Illustration of IFA: “-” means non-fluorescence; “+” means positive
fluorescence of 25% cells;“++” means positive fluorescence of 50% cells;“
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means positive fluorescence of 80% cells.
2.2 病毒对细胞的作用
CBV5感染细胞后12h，细胞出现CPE，细胞园缩，折光性增强，胞浆颗粒增加，部分园缩细胞从瓶壁上脱落。病毒感染细胞后20h，电镜下观察细胞出现明显的感染特征，胞浆空泡化，线粒体肿胀变性，内质网扩张，核固缩，异染色质增多并趋向核膜周围(图3A)，胞浆中可见排列不规则的病毒颗粒，园形，无囊膜，直径约20～30nm(图3B)。
图3 CBV5感染Hep-2细胞的超微结构
Fig.3 The change of ultrastructure of Hep-2 cells infected with CBV5
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A. nuclear degeneration, vesicle-like change in plasma; B. viral particles in cytoplasma (Bar=80nm)
3 讨论
迄今，关于CBV的致病性研究已有较多的报道，但其致病机制仍不清楚，国内外学者对CBV与细胞相互作用的关系所知甚少。为此，我们利用细胞学、免疫学和基因检测技术从不同侧面观察了CBV5在Hep-2细胞内的增殖动态。研究发现CBV感染细胞后4h即可检测到病毒RNA。这一结果与Martin等[5]的报道一致，他们指出小RNA病毒核酸在病毒吸附细胞2.0～3.5h后开始合成。Lyeke[6]也指出小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒)RNA在病毒感染细胞后2h大量合成。我们的这一发现是符合小RNA病毒的增殖特征的。为了证明病毒感染细胞后4h的RNA是新合成的还是接种时残存的病毒RNA，我们同步检测了CBV感染非允许性细胞(RK-13)4h的RNA为阴性，这也进一步说明病毒感染细胞4h的RNA可能是新合成的。
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对不同方法的比较研究发现，RT-PCR在病毒感染细胞4h后即可检测到CBV RNA，而IFA法在病毒感染后8h检测到CBV抗原，CPE则在12h出现，这表明基因检测技术在检测病毒感染方面最为敏感。
目前报道的CBV RNA提取方法主要有两种：蛋白酶K-酚-氯仿法和异硫氰酸胍-酚-氯仿法[7～9]。这两种方法提取RNA均需置-70℃ 2h或-20℃过夜沉淀RNA，所需时间长，不便于快速检测。我们根据Loparev等的报道用碘化钠提取DNA的方法[4]，结合异硫氰酸胍-酚-氯仿法，建立了碘化钠-异硫氰酸胍-氯仿法提取CBV RNA，并进行了三种提取方法的比较，结果表明三种方法制备的RNA均可用于PCR扩增，效果一致(资料未显示)。而我们的方法提取的RNA只需置室温15～
30min，且不需蛋白酶K、苯酚等试剂，说明我们的方法具有快速、价廉、安全等特点，可推广应用。
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* 湖北省“八.五”重点课题资助
参考文献
[1] Severini V, Mestroni L, Falaschi A et al. Nested polymerase chain reaction for high sensitivity detection of enteroviral RNA in biological samples. J Clin Microbiol, 1993,31(5):1345～1349
[2] 杨占秋，蒋文玲，朱宝莲.单纯疱疹病毒的免疫荧光点片法及其应用.蚌埠医学院学报，1985，10(2)：175～177
[3] Chomczynski P, Sachi N. Single-step method of RNA isolation by acid ganionium thiocyanate-phenol-chloform extraction. Anal Biochem, 1987,162(2):156～159
, 百拇医药
[4] Loparev VN, Cartas MA, Monken CE et al. An efficent and simple method of DNA extraction from whole blood and cells lines to identify infectious agent. J Virol Method 1991,34(2):105～112
[5] Martin EM. Replification of small RNA virus. Br Med Bull, 1967,23(2):192～197
[6] Philipson L. Replication, transcription and translation of RNA virus. In: Lycke E et al ed. Textbook of medical virology. England: Butterworth & Co Ltd. 1981.57～63
, 百拇医药
[7] Gow JG, Behan VHM, Clements GB et al. Enteroviral RNA sequences detected by polymease chain reaction in muscle of patients with posttive fatigue syndrome. Br Med J, 1991,302(6778):692～696
[8] Weiss LM, Movahed LA, Billing ME et al. Detection of coxsackievirus B3 RNA in myocardial tissues by the polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1991, 138(2):497～503
[9] Chapman NM, Tracy S, Gauntt CJ et al. Molecular detection and identification of enteroviral using enzymatic amplification and nucleic acid hybridization. J Clin Microbiol, 1990,28(5):843～850
收稿日期：1998-02-26，修回日期：1998-07-02, 百拇医药