ToRCH系列酶标诊断试剂的研制
作者：龚镇奎 黄 鹤 骆 林 肖红雨 龚 睿
单位：湖北省医学科学院病毒研究所，武汉 430079
关键词：ToRCH感染；间接ELISA；诊断试剂
中国病毒学990206 摘 要 报道了用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG和抗人IgM(u链)单克隆抗体作第二抗体，用自己培养、纯化的弓形体(To)、风疹病毒(RuV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒(HSV1-2)的虫体和病毒抗原包被酶标板，研制出检测ToRCH系列的特异性IgG和IgM的间接ELISA试剂。质量检定结果表明，该试剂特异性强、本底低，能有效消除RF因子等干扰因素的影响；灵敏度达1∶160～640；精密性好，变异系数(C.V)在1.4%～9.0%；试剂稳定，37℃存放4d，各项指标的变化率不超过15%。
Preparation of Indirect ELISA Reagent to Diagnose ToRCH Infection
, 百拇医药
Gong Zhenkui Huang He Luo Lin Xiao Hongyu Gong Rui
(Institute of Virology, Hubei Academy of Medical Science, Wuhan 430079)
Abstract Torch is the abbreviation of four pathgenic microbols: Tonoplasma gondic (Toxo), Rubella Virus (RuV), Cytomegalovirus (CMV), and Herpes Simplex Virus (HSV1-2). A new indirect ELISA reagent to detect the specific IgG and IgM antibody to ToRCH has been prepared. McAbs, labeled with horseradish peroxidase, against human IgG and IgM are used as the second antibodies. Purified Toxo, RuV, CMV, HSV1-2 are used as antigens to coat wells. The reagent's quality has been tested. The result showed that the reagent has high specificity and low background. The sensitivity is up to 1∶160～640, the precision is high and the coefficient of variation (C.V) is between 1.4%～9.0%. The reagent is stable (stored at 37 ℃ for 4 days, the change range of each target is no more than 15%).
, 百拇医药
Key words ToRCH infection, Indirect ELISA, Diagnose reagent
ToRCH是4种人类致病微生物英文名称字头的组合：To代表弓形体(Toxoplasma gondii，Toxo)；R代表风疹病毒(Rubella Virus, RuV)；C代表巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)；H代表单纯性疱疹病毒(Herpes Simplex Virus, HSV)。这4种病原微生物除容易感染人群引起多种疾病外，还有两个共同特征：其一是孕妇由于内分泌的改变和免疫力下降易发生原发性感染，既往感染的孕妇体内潜伏的病原体也易被激活而出现复发性感染，妊娠期感染不仅危害母体，往往可引起宫内感染而导致流产、早产、死胎。胎儿受感后，可能引起发育迟缓和先天畸形，造成新生儿智力障碍、各种瘫痪、失明、耳聋、失聪弱智等严重后果。其二是一般成人感染后症状较轻或不出现明显症状，不易被察觉而忽视。因此ToRCH感染的早期快速诊断对防止先天畸形、提高出生人口素质、优生优育有极其重要意义。目前关于ToRCH系列体外诊断试剂国内外虽上市，但国外产品价格昂贵，国内厂商大都是引进国外主要原料组装，其质量尚不尽人意。我们全部用自己生产的原材料、采用间接ELISA方法研制了ToRCH IgG、IgM检测试剂，并对其产品质量进行了全面鉴定，取得了令人满意的结果。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 毒(虫)种 本试验所用的Toxo虫种、RuV、CMV和HSV毒种、靶细胞(动物)来源见表1。
表1 毒(虫)种及靶细胞(动物)
Table 1 Virus (protozoon) and target cells (animals) 病原体
Pathogens
毒(虫)种
Virus (Proeozoon)
靶细胞(动物)
Target cells (Animals)
, 百拇医药
Toxo
Gondii
Kunming mouse
RubV
Gos
BHK21
CMV
AD169
HL
HSV-1
SM40
HeLa
HSV-2
, http://www.100md.com
333
HeLa
1.2 抗人IgG和抗人IgM(u链)单克隆抗体 由本所制备，方法见资料[1]。
1.3 弓形虫虫体抗原的制备 将冻存的弓形体虫种迅速置36～38℃水浴融化，用PBS洗涤离心去上清，沉下的虫体用PBS悬浮后注入小鼠腹腔复苏、增殖。收集腹水，离心，用PBS洗涤3次后，用0.25%胰酶消化10～15min，再用PBS洗3次，再冻融3次后超声破碎，离心取上清即为包被用虫体抗原。测定蛋白含量及工作浓度后加50%甘油，-20℃保存备用。
1.4 病毒抗原的制备 将RuV、CMV、HSV-1和HSV-2分别接种到相应的敏感细胞上培养，待细胞病变(CPE)达
～
后，收集培养液和/或病变细胞，采用相应措施对病毒抗原进行灭活处理，冻融3次，超声破碎，差速离心和甘油梯度离心纯化病毒抗原。测定蛋白含量和包被工作浓度后，加50%甘油-20℃保存备用。
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1.5 酶标抗体的制备 本试验中所用酶标抗体(二抗)是采用抗人IgG单克隆抗体和三株抗不同位点的抗人IgM(u链)单克隆抗体进行纯化、标记的。单克隆抗体杂交瘤细胞株为本所研制保存的[1]，按常规方法制备腹水抗体，用辛酸-硫酸铵沉淀法[2]纯化，采用辣根过氧化物酶(RZ≥3.0，Sigma产品)过碘酸氧化法标记[3]。
1.6 试剂盒的制备 检测抗ToRCH特异性IgG和IgM的试剂盒均采用间接ELISA方法制备。分别用4种纯化的抗原按常规[4]制备预包被板。在试剂盒中除配有已稀释到工作浓度的相应的底物溶液(TMB和H2O2)，阳性、阴性、临界值血清(弱阳性血清，弱阳性血清的定值是在普查了大量正常人阴性血清的基础上，按Cutoff值=2.1×阴性平均值+2SD来确定)外，在检测IgG的试剂盒中还配有能消除内源性过氧化物酶等干扰因子的血清样品稀释液，在检测IgM的试剂盒中配有能消除IgG、类风湿因子(RF)等干扰因子影响的血清样品稀释液。试剂盒中所有试液均用滴瓶分装，每滴50μL，直接使用。
, 百拇医药
1.7 血清样品的检测 按间接ELISA常规操作程序进行，即先滴加2滴(100μL)血清样品稀释液到预包被板的孔中，再加血清样品1μL(或将血清先用PBS稀释10倍后，再取10μL加入孔中)，37℃保温30min，洗板4～5次后，加入酶结合物2滴(100μL)，37℃保温30min，洗板、拍干，加底物A(TMB)和底物B(H2O2)各一滴(50μL)，37℃显色15min，观测结果。结果判断：①目测：显色深于弱阳性对照者为阳性，否则为阴性。②机测：先用1mol/L的H2SO4终止，用酶标检测仪测定各孔OD450值。OD450值>2.1×阴性对照OD值(阴性对照OD值小于0.1，按0.1计)者判为阳性，否则为阴性。
1.8 试剂盒的质量检定
1.8.1 取相应的阳性和阴性血清(RuV IgM和 IgG阳性血清来自江陵某中学一次风疹流行时的急性期和恢复期血清，CMV阳性血清由同济医大小儿科和武汉市儿童医院提供，其它阳性血清及阴性血清是从普查中筛选的)各10份，分别用相应的试剂盒进行检测，应不出现假阴性和假阳性。
, 百拇医药
1.8.2 阻断试验 将阳性血清(ELISA检测OD大0.4左右)与相应的抗原(2mg/mL)等量混合，37℃中和30min，然后同时测定中和前和中和后的血清，阻断率应>50%。
阻断率=
×100%
1.8.3 对IgM检测试剂加试了巯基乙醇破坏试验和RF因子影响试验。
1.9 灵敏度 将各种ToRCH阳性血清用相应的血清样品稀释液从1∶10开始作倍比稀释，在相应的试剂盒中检测，以最高稀释孔为阳性的稀释倍数定为灵敏度。
1.10 精密性 用一份阳性血清同时做10孔，计算其变异系数(C.V)。
1.11 稳定性 将试剂盒分别置4℃和37℃存放4d，然后同步检测同一份阳性血清及试剂盒中阳参、弱阳参和阴参血清，按下述公式计算变化率(%)。
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变化率(%)=
×100%
2 结果
2.1 试剂的特异性检定
随机挑选ToRCH IgG、IgM阳性和阴性血清样品各10份，分别用相应的试剂盒检测，结果见表2。没有出现一份假阳性和假阴性。阴性血清样品的OD值均在0.10以下(用国营华东电子管厂制造的DG5030型酶联免疫检测仪检测，下同)。
表2 特异性检定结果
Table 2 The results of sepecificity assay 试剂盒
Kit
, http://www.100md.com 血清
Sera
血 清 样 品
Serum sample
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
, http://www.100md.com
阳参
P.C
弱阳参
W.P.C
阴参
N.C
Toxo
IgM阳性血清(P.S)
0.565
0.648
0.727
0.731
0.776
, 百拇医药
0.829
0.856
0.572
0.437
0.609
0.784
0.268
0.025
IgM阴性血清(N.S)
0.013
0.073
0.066
0.009
, 百拇医药
0.004
0.016
0.000
0.084
0.015
0.017
IgG阳性血清(P.S)
0.744
0.733
0.365
0.482
0.523
0.723
, 百拇医药
0.610
0.480
0.554
0.688
0.681
0.192
0.004
IgG阴性血清(N.S)
0.007
0.012
0.024
0.012
0.042
, 百拇医药
0.065
0.071
0.020
0.071
0.082
RuV
IgM阳性血清(P.S)
0.572
0.472
0.646
0.751
0.501
0.525
, http://www.100md.com
0.448
0.678
0.499
0.631
0.672
0.246
0.030
IgM阴性血清(N.S)
0.070
0.065
0.055
0.007
0.060
, http://www.100md.com
0.085
0.013
0.000
0.002
0.006
IgG阳性血清(P.S)
0.734
0.732
0.654
0.691
0.521
0.454
0.385
, 百拇医药
0.710
0.456
0.484
0.700
0.202
0.009
IgG阴性血清(N.S)
0.080
0.060
0.002
0.048
0.009
0.052
, 百拇医药
0.061
0.074
0.056
0.003
CMV
IgM阳性血清(P.S)
0.508
0.700
0.575
0.634
0.617
0.705
0.589
, 百拇医药
0.665
0.585
0.647
0.726
0.228
0.040
IgM阴性血清(N.S)
0.034
0.044
0.000
0.001
0.051
0.054
, http://www.100md.com
0.000
0.000
0.027
0.043
IgG阳性血清(P.S)
0.555
0.479
0.461
0.592
0.610
0.702
0.385
0.748
, http://www.100md.com
0.309
0.568
0.737
0.199
0.019
IgG阴性血清(N.S)
0.078
0.100
0.066
0.061
0.009
0.080
0.041
, 百拇医药
0.026
0.055
0.058
HSV
IgM阳性血清(P.S)
0.733
0.768
0.754
0.479
0.657
0.375
0.751
0.756
, 百拇医药
0.747
0.568
0.653
0.214
0.005
IgM阴性血清(N.S)
0.060
0.000
0.027
0.002
0.023
0.000
0.015
, 百拇医药
0.000
0.028
0.000
IgG阳性血清(P.C)
0.658
0.610
0.574
0.585
0.810
0.350
0.425
0.708
0.445
, 百拇医药
0.656
0.700
0.172
0.005
IgG阴性血清(N.S)_
0.048
0.079
0.075
0.004
0.036
0.000
0.062
, http://www.100md.com 0.080
0.006
0.053
Note: P.S is positive serum； N.S is negative serum； P.C is positive
control；W.P.C is weak positive control； N.C is negative control.
巯基乙醇破坏试验：由于巯基乙醇能将-S-S-键还原成-SH，破坏了IgM结构，从而使其失去活性。取9份风疹患者急性期血清各0.1mL，用PBS稀释10倍后，分成试验组和对照组，试验组中加入等量0.01mol/L 2-巯基乙醇，对照组中加入等量PBS，同时置37℃作用1h，然后用RuV IgM试剂盒检测，对照组呈阳性反应，试验组均转阴。结果见表3。
, http://www.100md.com
表3 9份RuV IgM阳性血清2-巯基乙醇处理前后的测定结果
Table 3 The results of 9 anti-RuV IgM positive sera assay before and after treatment with 2-mercapto ethanol 血清号
No.of serum
5～1
7～1
9～1
16～1
20～1
22～1
24～1
, 百拇医药
26～1
87
处理前
Before treatment
+
+
+
++
++
+
++
+
, 百拇医药
处理后
After treatment
-
-
-
-
-
-
-
-
-
阻断试验：取ToRCH IgM阳性血清各一份与相应的抗原混合，37℃中和30min，然后同时用相应的试剂盒检测中和前和中和后的OD值。结果见表4。 表4 阻断试验结果
, 百拇医药
Table 4 The results of block test 试剂盒
Kit
中和前
Before neutralization
中和后
After neutralization
阻断率(%)
Block rate
Toxo
0.330
0.145
, http://www.100md.com
56.1
RubV
0.433
0.041
90.5
CMV
0.490
0.130
76.3
HSV
0.409
0.111
72.9
, http://www.100md.com
RF因子影响试验：取RF阳性血清5份(其中强阳性2份，中等强度阳性2份，弱阳性1份)。用Toxo IgM试剂盒检测均为IgM阴性。随机取ToRCH IgM检测为阳性血清和阴性的血清各10份进行RF因子检测，在阴、阳血清中都检出了一定份数的RF因子阳性的血清(表5)。 表5 RF因子检测结果
Table 5 The results of RF factor assay ToRCH IgM阳性血清编号
No.of ToRCH IgM positive sera
1
2
3
4
5
, 百拇医药
6
7
8
9
10
RF胶乳凝集
RF latex agglatiration
-
++
-
-
-
, 百拇医药
±
-
-
ToRCH IgM阴性血清编号
No.of ToRCH IgM negetive sera
1
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药
8
9
10
RF胶乳凝集
RF latex agglatiration
++
-
-
-
-
-
-
-
, http://www.100md.com
++
-
2.2 灵敏度检测
结果见表6。OD450≥0.21判为阳性终点。
表6 灵敏度检测结果
Table 6 The results of sensitivity test 试剂盒
kit
阳性血清稀释度 Positive serum dilution
阳参
P.C
弱阳参
, 百拇医药
W.P.C
阴参
N.C
灵敏度
Sensitivity
1∶5
1∶10
1∶20
1∶40
1∶80
1∶160
1∶320
1∶640
, 百拇医药
1∶1280
ToxoIgG
0.744
0.637
0.545
0.423
0.352
0.246
0.138
0.041
0.014
0.681
0.192
, http://www.100md.com
0.031
1∶160
IgM
0.776
0.685
0.571
0.462
0.370
0.269
0.146
0.043
0.021
0.768
, http://www.100md.com
0.206
0.045
1∶160
RuVIgG
0.824
0.812
0.798
0.741
0.587
0.392
0.303
0.175
0.108
, 百拇医药
0.767
0.215
0.027
1∶320
IgM
0.824
0.829
0.779
.763
0.666
0.518
0.338
0.225
, http://www.100md.com
0.015
0.671
0.201
0.035
1∶640
CMVIgG
0.658
0.642
0.501
0.410
0.342
0.256
0.185
, http://www.100md.com
0.150
0.085
0.637
0.199
0.050
1∶160
IgM
0.588
0.536
0.442
0.385
0.309
0.264
, 百拇医药
0.201
0.148
0.079
0.624
0.228
0.040
1∶160
HSVIgG
0.547
0.517
0.431
0.376
0.307
, 百拇医药
0.234
0.176
0.131
0.064
0.603
0.225
0.045
1∶160
IgM
0.785
0.678
0.567
0.457
, http://www.100md.com
0.368
0.255
0.142
0.027
0.010
0.593
0.210
0.065
1∶160
Note:P.C is positive control; W.P.C is weak positive control; N.C is negative control.
2.3 稳定性试验
, http://www.100md.com
试剂盒置37℃存放4d后，与4℃存放的试剂盒相比，各种参数的变化率均未超过±15%，结果见表7。
表7 ToRCH试剂盒稳定性试验结果
Table 7 The results of ToRCH kit stability test 试剂盒
Kit
测试血清
Sera tested
存放4天 After 4 days
变化率
Variation(%)
4℃
, http://www.100md.com
37℃
Toxo
阳性血清样品(P.S)
阳 参(P.C)
0.320
0.345
+7.8
弱阳参(W.P.C)
0.616
0.652
+5.8
阴 参(N.C)
, 百拇医药 0.255
0.223
-12.5
0.035*
0.030
0
RuV
阳性血清样品(P.S)
0.404
0.395
-2.2
阳 参(P.C)
, 百拇医药 0.636
0.541
-14.9
弱阳参(W.P.C)
0.237
0.231
-2.5
阴 参(N.C)
0.000
0.004
0
CMV
阳性血清样品(P.S)
, 百拇医药
0.315
0.324
+2.9
阳 参(P.C)
0.524
0.462
-11.8
弱阳参(W.P.C)
0.171
0.175
+2.3
阴 参(N.C)
, 百拇医药 0.034
0.026
0
HSV
阳性血清样品(P.S)
0.362
0.345
-4.7
阳 参(P.C)
0.628
0.652
+3.8
弱阳参(W.P.C)
, http://www.100md.com
0.220
0.204
-7.3
阴 参(N.C)
0.023
0.007
0
* OD<0.05，按0.05计算。* OD<0.05，calculated by 0.05.
2.4 精密性试验
同一份阳性血清用相应的试剂盒连续测10孔，根据各孔OD值，计算变异系数(C.V)。结果见表8。
, http://www.100md.com
表8 精密性检测结果
Table 8 The results of precision test 试剂盒
Kit
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
, 百拇医药
SD
C.V(%)
Toxo
IgG
0.242
0.246
0.249
0.277
0.280
0.253
0.255
0.258
0.287
, 百拇医药
0.320
0.267
0.024
9.00
IgM
0.493
0.442
0.459
0.498
0.475
0.486
0.468
0.474
, 百拇医药
0.503
0.498
0.480
0.020
4.16
RuV
IgG
0.795
0.759
0.779
0.772
0.788
0.765
, http://www.100md.com
0.783
0.778
0.767
0.786
0.777
0.011
1.40
IgM
0.667
0.652
0.661
0.687
0.646
, http://www.100md.com
0.650
0.660
0.676
0.627
0.626
0.662
0.019
2.87
CMV
IgG
0.575
0.587
0.599
, 百拇医药
0.573
0.5670
.573
0.566
0.575
0.582
0.559
0.576
0.011
1.90
IgM
0.474
0.453
, 百拇医药
0.514
0.501
0.526
0.502
0.532
0.478
0.510
0.492
0.498
0.024
4.82
HSV
IgG
, 百拇医药
0.643
0.626
0.595
0.657
0.663
0.616
0.663
0.611
0.656
0.669
0.640
0.026
4.10
, 百拇医药
IgM
0.651
0.662
0.671
0.682
0.690
0.707
0.711
0.691
0.702
0.689
0.686
0.019
, http://www.100md.com
2.77
3 讨论
ToRCH感染不仅能引起人类各种疾病，孕妇感染后会引起宫内感染，可能造成流产、死胎和新生儿先天性畸形，对出生人口素质有直接影响。因此，对ToRCH感染的诊断引起人们的高度重视。一些发达国家已将ToRCH感染的检测作为婚前、孕前和孕期的常规检测项目，我国近几年也相继开展这方面检测。国内外目前已有ToRCH系列诊断试剂面市，但国外原装试剂价格昂贵，国内厂家大多引进国外公司的主要原材料进行组装，其质量尚不尽人意，尤其是阴性本底高，特异性欠佳，假阳性或假阴性的情况普遍存在。本所研制的ToRCH系列诊断试验，所有原材料都是自己研制生产的。我们所用酶标抗体(二抗)全是单克隆抗体，减少了多克隆抗体中一些非特异性因子的干扰。同时我们采用多株抗不同位点的单抗混合标记，提高了试剂的灵敏度。此外，在检测IgM试剂盒中，血清样品稀释液内加入了适量羊抗人IgG抗体，这不仅可防止IgG与IgM竞争抗原位点，提高IgM检测的灵敏度，而且可以排除RF因子的干扰[6]。试剂盒中阴性参考血清的OD值一般在0.05左右，我们检测了近400名ToRCH抗体阴性正常人血清，平均OD值也只在0.1左右。在试剂的稳定性方面，我们在酶标抗体、阳性、弱阳性参考血清中加入能有效保护抗体蛋白的保护剂，使试剂盒的稳定性得到有效提高，37℃存放4d(相当于4℃存放6个月)，各项指标的变化率小于15%。目前我国还没有正式颁发ToRCH系列酶标诊断试剂盒的质量检定规程。我们参照已颁布的其它酶标试剂盒的质检规程[5]，从特异性、灵敏度、精密性和稳定性等方面进行了检定，结果是令人满意的。本所用此套试剂对武汉地区育龄妇女和孕妇进行了ToRCH抗体水平的调查[7，8]，得到了令人满意的结果。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] 田慕贞，董继华，李川江等.分泌抗人IgM(链)单克隆抗体细胞株的建立与鉴定.中华免疫学杂志，1985，6：1～4
[2] 詹发先，龚镇奎，王玉娥.两种方法提纯的抗-HBe单克隆抗体及其酶结合物的比较.湖北预防医学杂志，1995，6(4)：4～6
[3] 宋干主编.流行性出血热防治手册，1987.227～228
[4] 黄鹤，龚镇奎，肖红雨.抗-HBc检测试剂中3种预包被方法的效果比较.湖北预防医学杂志，1995，6(4)：1～3
[5] 中华人民共和国卫生部.中国生物制品规程二部.1993.
[6] 闵福援，吴昊，王健等.用ELISA法检测丙型肝炎病毒IgM抗体试剂盒的研究.中华实验和临床病毒学杂志，1996，8(2)：158～160
[7] 肖红雨，骆林，黄鹤等.育龄ToRCH黯然的情况调查.社会与医学，1997，9：12～13
[8] 骆林，肖红雨，黄鹤等.孕妇孕娠期ToRCH感染的情况调查.湖北预防医学杂志，1997，8(增刊)：56～57
收稿日期：1998-04-17，修回日期：1998-08-10, 百拇医药
单位：湖北省医学科学院病毒研究所，武汉 430079
关键词：ToRCH感染；间接ELISA；诊断试剂
中国病毒学990206 摘 要 报道了用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG和抗人IgM(u链)单克隆抗体作第二抗体，用自己培养、纯化的弓形体(To)、风疹病毒(RuV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒(HSV1-2)的虫体和病毒抗原包被酶标板，研制出检测ToRCH系列的特异性IgG和IgM的间接ELISA试剂。质量检定结果表明，该试剂特异性强、本底低，能有效消除RF因子等干扰因素的影响；灵敏度达1∶160～640；精密性好，变异系数(C.V)在1.4%～9.0%；试剂稳定，37℃存放4d，各项指标的变化率不超过15%。
Preparation of Indirect ELISA Reagent to Diagnose ToRCH Infection
, 百拇医药
Gong Zhenkui Huang He Luo Lin Xiao Hongyu Gong Rui
(Institute of Virology, Hubei Academy of Medical Science, Wuhan 430079)
Abstract Torch is the abbreviation of four pathgenic microbols: Tonoplasma gondic (Toxo), Rubella Virus (RuV), Cytomegalovirus (CMV), and Herpes Simplex Virus (HSV1-2). A new indirect ELISA reagent to detect the specific IgG and IgM antibody to ToRCH has been prepared. McAbs, labeled with horseradish peroxidase, against human IgG and IgM are used as the second antibodies. Purified Toxo, RuV, CMV, HSV1-2 are used as antigens to coat wells. The reagent's quality has been tested. The result showed that the reagent has high specificity and low background. The sensitivity is up to 1∶160～640, the precision is high and the coefficient of variation (C.V) is between 1.4%～9.0%. The reagent is stable (stored at 37 ℃ for 4 days, the change range of each target is no more than 15%).
, 百拇医药
Key words ToRCH infection, Indirect ELISA, Diagnose reagent
ToRCH是4种人类致病微生物英文名称字头的组合：To代表弓形体(Toxoplasma gondii，Toxo)；R代表风疹病毒(Rubella Virus, RuV)；C代表巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)；H代表单纯性疱疹病毒(Herpes Simplex Virus, HSV)。这4种病原微生物除容易感染人群引起多种疾病外，还有两个共同特征：其一是孕妇由于内分泌的改变和免疫力下降易发生原发性感染，既往感染的孕妇体内潜伏的病原体也易被激活而出现复发性感染，妊娠期感染不仅危害母体，往往可引起宫内感染而导致流产、早产、死胎。胎儿受感后，可能引起发育迟缓和先天畸形，造成新生儿智力障碍、各种瘫痪、失明、耳聋、失聪弱智等严重后果。其二是一般成人感染后症状较轻或不出现明显症状，不易被察觉而忽视。因此ToRCH感染的早期快速诊断对防止先天畸形、提高出生人口素质、优生优育有极其重要意义。目前关于ToRCH系列体外诊断试剂国内外虽上市，但国外产品价格昂贵，国内厂商大都是引进国外主要原料组装，其质量尚不尽人意。我们全部用自己生产的原材料、采用间接ELISA方法研制了ToRCH IgG、IgM检测试剂，并对其产品质量进行了全面鉴定，取得了令人满意的结果。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 毒(虫)种 本试验所用的Toxo虫种、RuV、CMV和HSV毒种、靶细胞(动物)来源见表1。
表1 毒(虫)种及靶细胞(动物)
Table 1 Virus (protozoon) and target cells (animals) 病原体
Pathogens
毒(虫)种
Virus (Proeozoon)
靶细胞(动物)
Target cells (Animals)
, 百拇医药
Toxo
Gondii
Kunming mouse
RubV
Gos
BHK21
CMV
AD169
HL
HSV-1
SM40
HeLa
HSV-2
, http://www.100md.com
333
HeLa
1.2 抗人IgG和抗人IgM(u链)单克隆抗体 由本所制备，方法见资料[1]。
1.3 弓形虫虫体抗原的制备 将冻存的弓形体虫种迅速置36～38℃水浴融化，用PBS洗涤离心去上清，沉下的虫体用PBS悬浮后注入小鼠腹腔复苏、增殖。收集腹水，离心，用PBS洗涤3次后，用0.25%胰酶消化10～15min，再用PBS洗3次，再冻融3次后超声破碎，离心取上清即为包被用虫体抗原。测定蛋白含量及工作浓度后加50%甘油，-20℃保存备用。
1.4 病毒抗原的制备 将RuV、CMV、HSV-1和HSV-2分别接种到相应的敏感细胞上培养，待细胞病变(CPE)达
～后，收集培养液和/或病变细胞，采用相应措施对病毒抗原进行灭活处理，冻融3次，超声破碎，差速离心和甘油梯度离心纯化病毒抗原。测定蛋白含量和包被工作浓度后，加50%甘油-20℃保存备用。, http://www.100md.com
1.5 酶标抗体的制备 本试验中所用酶标抗体(二抗)是采用抗人IgG单克隆抗体和三株抗不同位点的抗人IgM(u链)单克隆抗体进行纯化、标记的。单克隆抗体杂交瘤细胞株为本所研制保存的[1]，按常规方法制备腹水抗体，用辛酸-硫酸铵沉淀法[2]纯化，采用辣根过氧化物酶(RZ≥3.0，Sigma产品)过碘酸氧化法标记[3]。
1.6 试剂盒的制备 检测抗ToRCH特异性IgG和IgM的试剂盒均采用间接ELISA方法制备。分别用4种纯化的抗原按常规[4]制备预包被板。在试剂盒中除配有已稀释到工作浓度的相应的底物溶液(TMB和H2O2)，阳性、阴性、临界值血清(弱阳性血清，弱阳性血清的定值是在普查了大量正常人阴性血清的基础上，按Cutoff值=2.1×阴性平均值+2SD来确定)外，在检测IgG的试剂盒中还配有能消除内源性过氧化物酶等干扰因子的血清样品稀释液，在检测IgM的试剂盒中配有能消除IgG、类风湿因子(RF)等干扰因子影响的血清样品稀释液。试剂盒中所有试液均用滴瓶分装，每滴50μL，直接使用。
, 百拇医药
1.7 血清样品的检测 按间接ELISA常规操作程序进行，即先滴加2滴(100μL)血清样品稀释液到预包被板的孔中，再加血清样品1μL(或将血清先用PBS稀释10倍后，再取10μL加入孔中)，37℃保温30min，洗板4～5次后，加入酶结合物2滴(100μL)，37℃保温30min，洗板、拍干，加底物A(TMB)和底物B(H2O2)各一滴(50μL)，37℃显色15min，观测结果。结果判断：①目测：显色深于弱阳性对照者为阳性，否则为阴性。②机测：先用1mol/L的H2SO4终止，用酶标检测仪测定各孔OD450值。OD450值>2.1×阴性对照OD值(阴性对照OD值小于0.1，按0.1计)者判为阳性，否则为阴性。
1.8 试剂盒的质量检定
1.8.1 取相应的阳性和阴性血清(RuV IgM和 IgG阳性血清来自江陵某中学一次风疹流行时的急性期和恢复期血清，CMV阳性血清由同济医大小儿科和武汉市儿童医院提供，其它阳性血清及阴性血清是从普查中筛选的)各10份，分别用相应的试剂盒进行检测，应不出现假阴性和假阳性。
, 百拇医药
1.8.2 阻断试验 将阳性血清(ELISA检测OD大0.4左右)与相应的抗原(2mg/mL)等量混合，37℃中和30min，然后同时测定中和前和中和后的血清，阻断率应>50%。
阻断率=
×100%1.8.3 对IgM检测试剂加试了巯基乙醇破坏试验和RF因子影响试验。
1.9 灵敏度 将各种ToRCH阳性血清用相应的血清样品稀释液从1∶10开始作倍比稀释，在相应的试剂盒中检测，以最高稀释孔为阳性的稀释倍数定为灵敏度。
1.10 精密性 用一份阳性血清同时做10孔，计算其变异系数(C.V)。
1.11 稳定性 将试剂盒分别置4℃和37℃存放4d，然后同步检测同一份阳性血清及试剂盒中阳参、弱阳参和阴参血清，按下述公式计算变化率(%)。
, http://www.100md.com
变化率(%)=
×100%2 结果
2.1 试剂的特异性检定
随机挑选ToRCH IgG、IgM阳性和阴性血清样品各10份，分别用相应的试剂盒检测，结果见表2。没有出现一份假阳性和假阴性。阴性血清样品的OD值均在0.10以下(用国营华东电子管厂制造的DG5030型酶联免疫检测仪检测，下同)。
表2 特异性检定结果
Table 2 The results of sepecificity assay 试剂盒
Kit
, http://www.100md.com 血清
Sera
血 清 样 品
Serum sample
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
, http://www.100md.com
阳参
P.C
弱阳参
W.P.C
阴参
N.C
Toxo
IgM阳性血清(P.S)
0.565
0.648
0.727
0.731
0.776
, 百拇医药
0.829
0.856
0.572
0.437
0.609
0.784
0.268
0.025
IgM阴性血清(N.S)
0.013
0.073
0.066
0.009
, 百拇医药
0.004
0.016
0.000
0.084
0.015
0.017
IgG阳性血清(P.S)
0.744
0.733
0.365
0.482
0.523
0.723
, 百拇医药
0.610
0.480
0.554
0.688
0.681
0.192
0.004
IgG阴性血清(N.S)
0.007
0.012
0.024
0.012
0.042
, 百拇医药
0.065
0.071
0.020
0.071
0.082
RuV
IgM阳性血清(P.S)
0.572
0.472
0.646
0.751
0.501
0.525
, http://www.100md.com
0.448
0.678
0.499
0.631
0.672
0.246
0.030
IgM阴性血清(N.S)
0.070
0.065
0.055
0.007
0.060
, http://www.100md.com
0.085
0.013
0.000
0.002
0.006
IgG阳性血清(P.S)
0.734
0.732
0.654
0.691
0.521
0.454
0.385
, 百拇医药
0.710
0.456
0.484
0.700
0.202
0.009
IgG阴性血清(N.S)
0.080
0.060
0.002
0.048
0.009
0.052
, 百拇医药
0.061
0.074
0.056
0.003
CMV
IgM阳性血清(P.S)
0.508
0.700
0.575
0.634
0.617
0.705
0.589
, 百拇医药
0.665
0.585
0.647
0.726
0.228
0.040
IgM阴性血清(N.S)
0.034
0.044
0.000
0.001
0.051
0.054
, http://www.100md.com
0.000
0.000
0.027
0.043
IgG阳性血清(P.S)
0.555
0.479
0.461
0.592
0.610
0.702
0.385
0.748
, http://www.100md.com
0.309
0.568
0.737
0.199
0.019
IgG阴性血清(N.S)
0.078
0.100
0.066
0.061
0.009
0.080
0.041
, 百拇医药
0.026
0.055
0.058
HSV
IgM阳性血清(P.S)
0.733
0.768
0.754
0.479
0.657
0.375
0.751
0.756
, 百拇医药
0.747
0.568
0.653
0.214
0.005
IgM阴性血清(N.S)
0.060
0.000
0.027
0.002
0.023
0.000
0.015
, 百拇医药
0.000
0.028
0.000
IgG阳性血清(P.C)
0.658
0.610
0.574
0.585
0.810
0.350
0.425
0.708
0.445
, 百拇医药
0.656
0.700
0.172
0.005
IgG阴性血清(N.S)_
0.048
0.079
0.075
0.004
0.036
0.000
0.062
, http://www.100md.com 0.080
0.006
0.053
Note: P.S is positive serum； N.S is negative serum； P.C is positive
control；W.P.C is weak positive control； N.C is negative control.
巯基乙醇破坏试验：由于巯基乙醇能将-S-S-键还原成-SH，破坏了IgM结构，从而使其失去活性。取9份风疹患者急性期血清各0.1mL，用PBS稀释10倍后，分成试验组和对照组，试验组中加入等量0.01mol/L 2-巯基乙醇，对照组中加入等量PBS，同时置37℃作用1h，然后用RuV IgM试剂盒检测，对照组呈阳性反应，试验组均转阴。结果见表3。
, http://www.100md.com
表3 9份RuV IgM阳性血清2-巯基乙醇处理前后的测定结果
Table 3 The results of 9 anti-RuV IgM positive sera assay before and after treatment with 2-mercapto ethanol 血清号
No.of serum
5～1
7～1
9～1
16～1
20～1
22～1
24～1
, 百拇医药
26～1
87
处理前
Before treatment
+
+
+
++
++
+
++
+
, 百拇医药
处理后
After treatment
-
-
-
-
-
-
-
-
-
阻断试验：取ToRCH IgM阳性血清各一份与相应的抗原混合，37℃中和30min，然后同时用相应的试剂盒检测中和前和中和后的OD值。结果见表4。 表4 阻断试验结果
, 百拇医药
Table 4 The results of block test 试剂盒
Kit
中和前
Before neutralization
中和后
After neutralization
阻断率(%)
Block rate
Toxo
0.330
0.145
, http://www.100md.com
56.1
RubV
0.433
0.041
90.5
CMV
0.490
0.130
76.3
HSV
0.409
0.111
72.9
, http://www.100md.com
RF因子影响试验：取RF阳性血清5份(其中强阳性2份，中等强度阳性2份，弱阳性1份)。用Toxo IgM试剂盒检测均为IgM阴性。随机取ToRCH IgM检测为阳性血清和阴性的血清各10份进行RF因子检测，在阴、阳血清中都检出了一定份数的RF因子阳性的血清(表5)。 表5 RF因子检测结果
Table 5 The results of RF factor assay ToRCH IgM阳性血清编号
No.of ToRCH IgM positive sera
1
2
3
4
5
, 百拇医药
6
7
8
9
10
RF胶乳凝集
RF latex agglatiration
-
++
-
-
-
, 百拇医药
±
-
-
ToRCH IgM阴性血清编号
No.of ToRCH IgM negetive sera
1
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药
8
9
10
RF胶乳凝集
RF latex agglatiration
++
-
-
-
-
-
-
-
, http://www.100md.com
++
-
2.2 灵敏度检测
结果见表6。OD450≥0.21判为阳性终点。
表6 灵敏度检测结果
Table 6 The results of sensitivity test 试剂盒
kit
阳性血清稀释度 Positive serum dilution
阳参
P.C
弱阳参
, 百拇医药
W.P.C
阴参
N.C
灵敏度
Sensitivity
1∶5
1∶10
1∶20
1∶40
1∶80
1∶160
1∶320
1∶640
, 百拇医药
1∶1280
ToxoIgG
0.744
0.637
0.545
0.423
0.352
0.246
0.138
0.041
0.014
0.681
0.192
, http://www.100md.com
0.031
1∶160
IgM
0.776
0.685
0.571
0.462
0.370
0.269
0.146
0.043
0.021
0.768
, http://www.100md.com
0.206
0.045
1∶160
RuVIgG
0.824
0.812
0.798
0.741
0.587
0.392
0.303
0.175
0.108
, 百拇医药
0.767
0.215
0.027
1∶320
IgM
0.824
0.829
0.779
.763
0.666
0.518
0.338
0.225
, http://www.100md.com
0.015
0.671
0.201
0.035
1∶640
CMVIgG
0.658
0.642
0.501
0.410
0.342
0.256
0.185
, http://www.100md.com
0.150
0.085
0.637
0.199
0.050
1∶160
IgM
0.588
0.536
0.442
0.385
0.309
0.264
, 百拇医药
0.201
0.148
0.079
0.624
0.228
0.040
1∶160
HSVIgG
0.547
0.517
0.431
0.376
0.307
, 百拇医药
0.234
0.176
0.131
0.064
0.603
0.225
0.045
1∶160
IgM
0.785
0.678
0.567
0.457
, http://www.100md.com
0.368
0.255
0.142
0.027
0.010
0.593
0.210
0.065
1∶160
Note:P.C is positive control; W.P.C is weak positive control; N.C is negative control.
2.3 稳定性试验
, http://www.100md.com
试剂盒置37℃存放4d后，与4℃存放的试剂盒相比，各种参数的变化率均未超过±15%，结果见表7。
表7 ToRCH试剂盒稳定性试验结果
Table 7 The results of ToRCH kit stability test 试剂盒
Kit
测试血清
Sera tested
存放4天 After 4 days
变化率
Variation(%)
4℃
, http://www.100md.com
37℃
Toxo
阳性血清样品(P.S)
阳 参(P.C)
0.320
0.345
+7.8
弱阳参(W.P.C)
0.616
0.652
+5.8
阴 参(N.C)
, 百拇医药 0.255
0.223
-12.5
0.035*
0.030
0
RuV
阳性血清样品(P.S)
0.404
0.395
-2.2
阳 参(P.C)
, 百拇医药 0.636
0.541
-14.9
弱阳参(W.P.C)
0.237
0.231
-2.5
阴 参(N.C)
0.000
0.004
0
CMV
阳性血清样品(P.S)
, 百拇医药
0.315
0.324
+2.9
阳 参(P.C)
0.524
0.462
-11.8
弱阳参(W.P.C)
0.171
0.175
+2.3
阴 参(N.C)
, 百拇医药 0.034
0.026
0
HSV
阳性血清样品(P.S)
0.362
0.345
-4.7
阳 参(P.C)
0.628
0.652
+3.8
弱阳参(W.P.C)
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0.220
0.204
-7.3
阴 参(N.C)
0.023
0.007
0
* OD<0.05，按0.05计算。* OD<0.05，calculated by 0.05.
2.4 精密性试验
同一份阳性血清用相应的试剂盒连续测10孔，根据各孔OD值，计算变异系数(C.V)。结果见表8。
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表8 精密性检测结果
Table 8 The results of precision test 试剂盒
Kit
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
, 百拇医药
SD
C.V(%)
Toxo
IgG
0.242
0.246
0.249
0.277
0.280
0.253
0.255
0.258
0.287
, 百拇医药
0.320
0.267
0.024
9.00
IgM
0.493
0.442
0.459
0.498
0.475
0.486
0.468
0.474
, 百拇医药
0.503
0.498
0.480
0.020
4.16
RuV
IgG
0.795
0.759
0.779
0.772
0.788
0.765
, http://www.100md.com
0.783
0.778
0.767
0.786
0.777
0.011
1.40
IgM
0.667
0.652
0.661
0.687
0.646
, http://www.100md.com
0.650
0.660
0.676
0.627
0.626
0.662
0.019
2.87
CMV
IgG
0.575
0.587
0.599
, 百拇医药
0.573
0.5670
.573
0.566
0.575
0.582
0.559
0.576
0.011
1.90
IgM
0.474
0.453
, 百拇医药
0.514
0.501
0.526
0.502
0.532
0.478
0.510
0.492
0.498
0.024
4.82
HSV
IgG
, 百拇医药
0.643
0.626
0.595
0.657
0.663
0.616
0.663
0.611
0.656
0.669
0.640
0.026
4.10
, 百拇医药
IgM
0.651
0.662
0.671
0.682
0.690
0.707
0.711
0.691
0.702
0.689
0.686
0.019
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2.77
3 讨论
ToRCH感染不仅能引起人类各种疾病，孕妇感染后会引起宫内感染，可能造成流产、死胎和新生儿先天性畸形，对出生人口素质有直接影响。因此，对ToRCH感染的诊断引起人们的高度重视。一些发达国家已将ToRCH感染的检测作为婚前、孕前和孕期的常规检测项目，我国近几年也相继开展这方面检测。国内外目前已有ToRCH系列诊断试剂面市，但国外原装试剂价格昂贵，国内厂家大多引进国外公司的主要原材料进行组装，其质量尚不尽人意，尤其是阴性本底高，特异性欠佳，假阳性或假阴性的情况普遍存在。本所研制的ToRCH系列诊断试验，所有原材料都是自己研制生产的。我们所用酶标抗体(二抗)全是单克隆抗体，减少了多克隆抗体中一些非特异性因子的干扰。同时我们采用多株抗不同位点的单抗混合标记，提高了试剂的灵敏度。此外，在检测IgM试剂盒中，血清样品稀释液内加入了适量羊抗人IgG抗体，这不仅可防止IgG与IgM竞争抗原位点，提高IgM检测的灵敏度，而且可以排除RF因子的干扰[6]。试剂盒中阴性参考血清的OD值一般在0.05左右，我们检测了近400名ToRCH抗体阴性正常人血清，平均OD值也只在0.1左右。在试剂的稳定性方面，我们在酶标抗体、阳性、弱阳性参考血清中加入能有效保护抗体蛋白的保护剂，使试剂盒的稳定性得到有效提高，37℃存放4d(相当于4℃存放6个月)，各项指标的变化率小于15%。目前我国还没有正式颁发ToRCH系列酶标诊断试剂盒的质量检定规程。我们参照已颁布的其它酶标试剂盒的质检规程[5]，从特异性、灵敏度、精密性和稳定性等方面进行了检定，结果是令人满意的。本所用此套试剂对武汉地区育龄妇女和孕妇进行了ToRCH抗体水平的调查[7，8]，得到了令人满意的结果。
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参考文献
[1] 田慕贞，董继华，李川江等.分泌抗人IgM(链)单克隆抗体细胞株的建立与鉴定.中华免疫学杂志，1985，6：1～4
[2] 詹发先，龚镇奎，王玉娥.两种方法提纯的抗-HBe单克隆抗体及其酶结合物的比较.湖北预防医学杂志，1995，6(4)：4～6
[3] 宋干主编.流行性出血热防治手册，1987.227～228
[4] 黄鹤，龚镇奎，肖红雨.抗-HBc检测试剂中3种预包被方法的效果比较.湖北预防医学杂志，1995，6(4)：1～3
[5] 中华人民共和国卫生部.中国生物制品规程二部.1993.
[6] 闵福援，吴昊，王健等.用ELISA法检测丙型肝炎病毒IgM抗体试剂盒的研究.中华实验和临床病毒学杂志，1996，8(2)：158～160
[7] 肖红雨，骆林，黄鹤等.育龄ToRCH黯然的情况调查.社会与医学，1997，9：12～13
[8] 骆林，肖红雨，黄鹤等.孕妇孕娠期ToRCH感染的情况调查.湖北预防医学杂志，1997，8(增刊)：56～57
收稿日期：1998-04-17，修回日期：1998-08-10, 百拇医药