祛风清肺口服液抗Ⅰ型变态反应的实验研究
作者：胡学军 骆和生 吴谦
单位：胡学军(广州中医药大学第二附属医院中心实验室，广州 510120)；骆和生(广州中医药大学中药学院，广州 510405)；吴谦(广东省药物研究所，广州 510400)
关键词：祛风清肺口服液；治疗应用；咳嗽；中药疗法；祛风；清肺；超敏反应，速发型；免疫学；肥大细胞；药物作用；组胺释放；药物作用
广州中医药大学学报990113摘要：为探讨中药祛风清肺口服液治疗“风热喉痒咳嗽”的免疫学机理，用天花粉致敏大白鼠，分别观察各组致敏大鼠抗血清对正常大鼠皮肤被动过敏反应(PCA)的影响、模型组大鼠抗血清对各组大鼠(包括给药组与对照组)皮肤PCA的影响以及祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组织胺的影响。结果显示：皮内注射祛风清肺口服液低、高剂量组大鼠抗血清的大鼠皮肤皮片浸液的吸光度值比模型组降低(P<0.01或P<0.001)；注射模型组大鼠抗血清后，祛风清肺口服液低、高剂量组大鼠背部皮肤注射点皮片浸液光密度值比正常组降低(P<0.05)；祛风清肺口服液能抑制致敏大鼠腹腔肥大细胞释放组胺，与正常对照组相比，差异有显著性(P<0.01)。结果表明祛风清肺口服液有抗Ⅰ型变态反应作用，为其治疗“风热喉痒咳嗽”提供了一定的免疫药理学基础。
, 百拇医药
中图分类号：R593.1 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(1999)01-0045-04
An Experimental Study of Qufeng Qingfei Oral Liquid in Antagonizing
Type I Allergy
HU Xue-jun
(Central Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510120,China)
LUO He-sheng
, http://www.100md.com
( Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405,China)
WU Qian
( Guangdong Provincial Pharmaceutical Institute, Guangzhou 510400,China)
Abstract：The immunological mechanism of Qufeng Qingfei Oral Liquid(QQOL) in treating wind-heat type throat itching and cough was explored in this study. Five types of anti-serum (AS) of rats,i.e, AS of normal rats, AS of rats administrated with high and low dosages of QQOL(AS1,AS2),AS of model rats (AS3) and AS of rats administrated with cyclophosphamide, were prepared first.The effects of QQOL on passive cutaneous anaphylaxis (PCA) of normal rats injected with various types of AS, on PCA of rats in the treatment and control groups injected with AS3 and on the indirect release of histamine of celiac mastocyte were observed.The results showed that:(1) the absorption value of skin graft infusion of normal rats injected with AS1 and AS2 was lowered markedly(P<0.01 or P<0.001) as compared with that of rats injected with AS3;(2) After injection of AS3,the absorption value of rats in the treatment groups (with high and low dosages of QQOL respectively) was also lowered markedly (P<0.05) as compared with that in the normal group;(3)Indirect release of histamine of celiac mastocyte was inhibited in rats sensitized by Radix Trichosanthis (P<0.01) as compared with that in the control group. It is suggested that QQOL possesses an antagonistic effect on Type I allergy and this will supply a certain immunopharmacological basis for the treatment of wind-heat type throat itching and cough.
, http://www.100md.com
Key words:@QUFENG QINGFEI ORAL LIQUID/ther.use; GOUGH/TCD ther.; DISPELLING WIND;
CLEARING LUNG; HYPERSENSITIVITY,IMMEDIATE/immunology; MAST CELLS/drug eff.;
HISTAMINE LIBERATION/drug eff.
临床上外感风热咳嗽病人多伴有喉痒，但这未引起足够重视。笔者认为，外感风热是“风热喉痒咳嗽”发生的直接原因；结合现代医学研究，该病多有过敏因素存在，与Ⅰ型变态反应有关。用祛风清肺口服液治疗该病，取得良好疗效[1]。本文研究该口服液的抗Ⅰ型变态反应作用，以探讨其作用机理。
1 实验材料
, 百拇医药
1.1 药物及主要试剂
祛风清肺口服液(由麻黄、甘草、桃仁、桔梗、蝉蜕、石膏、大枣等组成)由广州中医药大学第一附属医院制剂室提供，生药含量1.93 kg/L，批号951023。组织胺：中科院生物化学所提供，批号911108。OPT(邻苯二甲醛)： Fluka 产品。伊文思蓝：上海化学试剂采购供应站进口分装。抗原：天花粉(1989年粗品，广东省药物研究所提供)。佐剂：市售4%氢氧化铝凝胶，用时以 500 mg 天花粉粗品溶于 60 mL 氢氧化铝凝胶中(含天花粉粗品 8.3 g/L)。
1.2 动物
SD 系大白鼠由广东省卫生厅医用动物场购入(合格证号：96A02)。
1.3 仪器
上海第三分析仪器厂生产的 722 型光栅分光光度计；日本岛津RF-510荧光分光光度计。
, http://www.100md.com
2 实验方法
2.1 祛风清肺口服液对大鼠被动皮肤过敏反应实验(PCA)[2]
2.1.1 抗血清的制备 选健康SD大白鼠20只，体重100～200 g，随机分为5组。除正常对照组外，每只大鼠双前肢皮下注射天花粉粗品氢氧化铝混悬液共0.4 mL。 3 d后，双后肢再同样免疫1次。同时，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺溶液 70 mg/kg；其余各组灌胃给药：祛风清肺口服液低剂量组(简称低剂量组，11.6 g/kg)、祛风清肺口服液高剂量组(简称高剂量组，23.2 g/kg)、正常组与模型组(天花粉致敏但未灌服中药)给予等量的生理盐水。第1次免疫后 15 d，各组大鼠颈动脉放血处死，离心得抗血清，并将每组中各个大鼠血清混合。
2.1.2 PCA预试 选大鼠4只，体重 150～200 g，剪去背部的毛，背部每点分别按下列浓度皮内注射模型组混合抗血清 0.1 mL (1∶1、1∶10、1∶20、1∶40)， 48 h 后进行抗原攻击，股静脉注射天花粉粗品 10 mg/kg (天花粉粗品用 1% 伊文思蓝溶液配成 1 mg/kg)。 20 min 后断头处死动物，翻转背部皮肤，观察效价。结果发现抗血清(1∶1、1∶10)注射点处有明显蓝斑。
, 百拇医药
2.1.3 PCA正式实验
2.1.3.1 各组大鼠抗血清对正常大鼠皮肤PCA的影响 选大鼠 40只，均分为 5 组。各组大鼠背部每点各皮内注射 0.1 mL所制备的混合抗血清。 48 h 后，同预试中方法攻击， 20 min 后，断头处死动物，剪开皮片观察，并用直径 10 mm 打孔器取下皮片，剪碎，加入 3 mL 丙酮-生理盐水(7∶3)混合溶液，浸泡过夜，3 000 r/min离心 10 min ，取上清液，用 722 型分光光度计在波长 610 nm 处测光密度(D，原称OD值)。
2.1.3.2 模型组抗血清对不同组大鼠皮肤PCA的影响 选大鼠 32 只，均分为 4 组。阳性对照组腹腔注射酮替芬 7.5 mg/kg，高、低剂量组灌胃给药，药量同前，正常组予等量生理盐水。大鼠背部每点各皮内注射 0.1 mL所制备的模型组混合抗血清。48 h后，同预试中方法攻击，仅阳性药物组在攻击前，用大鼠另一条股静脉注射酮替酚溶液 7.5 mg/kg，20 min后，断头处死动物，剪开皮片观察，其余步骤同2.1.3.1。
, 百拇医药
2.2 祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组织胺(histamine)的实验
2.2.1 大鼠腹腔肥大细胞释放组胺试验[3]取健康 SD 大白鼠4只，体重 150～220 g，雌雄各半。处死后腹腔注射台氏液(Tyrod's液，无钙，37℃) 10 mL/只，轻揉 90 次，吸出全部腹腔液于含 5 U肝素的 10 mL试管中，置水浴中，4℃，600 r/min离心 15 min，倾去上清，用冷 Tyrod's液再洗1次，同样离心，4管合并，以 7.0 mL Tyrod's液悬起细胞。在冰浴中将上述肥大细胞悬液(0.1 mL/管)、模型组混合抗血清(0.1 mL/管)分别加入各组小试管中，其中口服液(低)组已加入药物0.1 mL(1.93 kg/L)、口服液(高)组已加入药物0.1 mL(3.86 kg/L)、阳性药物组已加入酮替芬 0.1 mL (0.1 g/L)，正常对照组予0.1 mL生理盐水。孵育 5 min，摇匀，每管加天花粉 (10 g/L)0.1 mL。然后，置 37℃温育 15 min，立即置冰浴中中止反应。 4℃?2?500 r/min离心 20 min，分出上清和细胞沉淀。分别提取细胞内、外的组胺。上清中加 0.1 mol/L HCl 0.1 mL 煮沸 5 min，2?500 r/min，离心 15 min，取上清用于测定细胞外组胺；往细胞沉淀中加入 1.0 mL 生理盐水和 0.1 mol/L HCl 0.1 mL，亦煮沸 5 min，2?500 r/min离心 15 min，取上清用于测定细胞内组胺。每个数据均为平行复管的平均数。按下式计算组胺释放率(p释放)和抑制率(p抑制)。
, 百拇医药
2.2.2 组胺测定 按文献[4]方法处理样本，用荧光分光光度仪(岛津RF-510型)在发射波长 448 nm，荧光波长 350 nm处测定各管荧光强度(fluorescence intensity ,FI)。
2.2.3 Histamine 标准曲线 称组胺11.1 mg于100 mL0.1mol/L HCl中，形成10-3 mol/L组胺，然后吸0.1 mL于 100 mL 0.1 mol/L HCl中 ，形成10-6 mol/L(即含111 μg/L)，以后对半稀释，测出对应荧光强度(Y)。回归直线方程为：
Y=4.172+0.593X，r=0.998
3 结果
3.1 各组大鼠抗血清对正常大鼠皮肤PCA的影响
, http://www.100md.com
表1结果显示，祛风清肺口服液低、高剂量、阳性药物对照组混合抗血清注射点皮片浸液的吸光度值比模型组降低(P<0.01或P<0.001)。
表1 给药组大鼠混合抗血清与模型组大鼠混合抗血清对正常大鼠PCA的影响 组 别
N/只
D/(
)
模型组
8
0.176±0.036
阳性药物组
8
, http://www.100md.com
0.078±0.004**
高剂量组
8
0.041±0.006**
低剂量组
8
0.123±0.015*
统计方法：t检验(下同)； * 与模型组比较，P<0.01， ** P<0.001
3.2 模型组抗血清对各组大鼠皮肤PCA的影响
表2显示，祛风清肺口服液低、高剂量组大鼠注射点的皮片浸液光密度值比正常组降低(P<0.05)，表明祛风清肺口服液对天花粉致敏的大鼠被动皮肤过敏反应有抑制作用。
, 百拇医药
3.3 祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组织胺的影响
表2 模型组抗血清对各组大鼠PCA的影响 组 别
N/只
Q剂量/(g.kg-1)
D/()
正常对照组
8
0.176±0.036
口服液(低)组
, 百拇医药 8
11.6
0.100±0.045*
口服液(高)组
8
23.2
0.089±0.057*
酮替芬组
8
7.5×10-3
0.019±0.006**
, 百拇医药 * 与正常对照组比较，P<0.05， ** P<0.001
3.3 祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组织胺的影响
表3结果显示，祛风清肺口服液低、高剂量组均可抑制大鼠腹腔肥大细胞间接释放组胺，与正常对照组相比，P<0.01；口服液高剂量组与阳性药物组比较，差异无显著性(P>0.05)。
表3 祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组胺的影响 组 别
p释放/()%
p抑制/%
正常对照组
, 百拇医药
47.03±1.51
口服液(低)组
30.01±3.72*△
38.19
口服液(高)组
22.98±2.63*
51.14
酮替芬组
25.68±2.75*
45.39
* 与对照组比较，P<0.01； △ 与酮替芬组比较，P<0.05
, http://www.100md.com
4 讨论
4.1 祛风清肺口服液治疗风热喉痒咳嗽的可能机理
I型变态反应是由IgE抗体介导的速发型反应。我们曾用放免法(按天津德普生物技术和医学产品有限公司出品的总IgE免疫放射检测试剂盒说明书的操作步骤进行)测定各组大鼠抗血清、以及正常大白鼠血清中的总IgE的含量，结果发现各组的测定值之间无显著性差异(P>0.05)，说明天花粉致敏后的大鼠血清总IgE的含量并无明显升高。而吴氏[5]的实验证明，天花粉致敏大鼠后产生抗天花粉特异性IgE抗体。从表2可以看出，祛风清肺口服液低、高剂量组、阳性药物对照组混合抗血清注射点皮片浸液的吸光度值降低(P<0.01或P<0.001)。而介导 24～72 h 的PCA反应的是致敏大鼠血清中特异性的IgE抗体，这表明祛风清肺口服液可能是通过减少抗天花粉特异性IgE抗体的产生从而抗I型变态反应的。
组织胺预先储存在组织的肥大细胞和血液中的嗜碱性粒细胞中，是抗原刺激致敏机体后，肥大细胞释放出来的最主要的生物活性物质。我们采用组织胺荧光测定法[4]测定祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组胺的影响。该法是利用组织胺可与邻苯二甲醛(OPT)发生缩合反应，生成带有荧光的缩合物的原理。先将组织胺提取到正丁醇中，然后在荧光比色计上测定。实验结果发现：经抗原刺激后，正常组大鼠组织胺释放率为(47.03±1.51)%，经祛风清肺口服液保护后，仅有少量组织胺释放(P<0.01)。说明祛风清肺口服液确有保护肥大细胞，抑制组胺释放从而抗Ⅰ型变态反应的作用。
, http://www.100md.com
在Ⅰ型变态反应的效应阶段，释放出的生物活性介质均能使皮肤局部血管的通透性增加。被动皮肤过敏反应试验(PCA)结果发现：祛风清肺口服液低、高剂量组大鼠皮片D值(即OD值)比正常组降低(P<0.05)，表明该药能抑制PCA反应引起的血管通透性增加与炎症渗出。
以上可能是祛风清肺口服液在Ⅰ型变态反应发生的不同阶段抗过敏反应的机理，也可能是该药治疗“风热喉痒咳嗽”的免疫药理学基础。
4.2 方法学的问题
用天花粉作为抗原引起大鼠过敏模型的浓度多为2.5 g/L左右[5]，而我们所用的天花粉为广东省药物研究所提供的1989年的天花粉粗品，效价可能有所降低，故所配浓度较常用天花粉浓度高。
基金项目：广州中医药大学课题，课题号C96-22
, http://www.100md.com 作者简介：胡学军，男，硕士研究生，药师
参考文献：
[1] 骆和生，苏雪英.喉痒咳嗽213例证治分析[J].中国医药学报，1989，4(4)：33
[2] 李仪奎主编.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1996.449
[3] 殷凯生.一种改良的嗜碱细胞组胺释放试验[J].中华微生物学和免疫学杂志，1983，3(6)：362
[4] 窦淑筠，符云峰.血及组织中组胺的荧光测定法[J].中华医学检验杂志，1981，4(2)：100
[5] 吴若钅 术，张淑敏，马佳雯，等.天花粉引起被动肺过敏的大鼠模型[J].中国药理学报，1985，3(1)：68
[6] 谭生建，王 琰，刘 刚，等.补骨脂酊中补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱测定法[J].中国中药杂志，1995，20(2)：99
收稿日期：1998-10-09, 百拇医药
单位：胡学军(广州中医药大学第二附属医院中心实验室，广州 510120)；骆和生(广州中医药大学中药学院，广州 510405)；吴谦(广东省药物研究所，广州 510400)
关键词：祛风清肺口服液；治疗应用；咳嗽；中药疗法；祛风；清肺；超敏反应，速发型；免疫学；肥大细胞；药物作用；组胺释放；药物作用
广州中医药大学学报990113摘要：为探讨中药祛风清肺口服液治疗“风热喉痒咳嗽”的免疫学机理，用天花粉致敏大白鼠，分别观察各组致敏大鼠抗血清对正常大鼠皮肤被动过敏反应(PCA)的影响、模型组大鼠抗血清对各组大鼠(包括给药组与对照组)皮肤PCA的影响以及祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组织胺的影响。结果显示：皮内注射祛风清肺口服液低、高剂量组大鼠抗血清的大鼠皮肤皮片浸液的吸光度值比模型组降低(P<0.01或P<0.001)；注射模型组大鼠抗血清后，祛风清肺口服液低、高剂量组大鼠背部皮肤注射点皮片浸液光密度值比正常组降低(P<0.05)；祛风清肺口服液能抑制致敏大鼠腹腔肥大细胞释放组胺，与正常对照组相比，差异有显著性(P<0.01)。结果表明祛风清肺口服液有抗Ⅰ型变态反应作用，为其治疗“风热喉痒咳嗽”提供了一定的免疫药理学基础。
, 百拇医药
中图分类号：R593.1 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(1999)01-0045-04
An Experimental Study of Qufeng Qingfei Oral Liquid in Antagonizing
Type I Allergy
HU Xue-jun
(Central Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510120,China)
LUO He-sheng
, http://www.100md.com
( Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405,China)
WU Qian
( Guangdong Provincial Pharmaceutical Institute, Guangzhou 510400,China)
Abstract：The immunological mechanism of Qufeng Qingfei Oral Liquid(QQOL) in treating wind-heat type throat itching and cough was explored in this study. Five types of anti-serum (AS) of rats,i.e, AS of normal rats, AS of rats administrated with high and low dosages of QQOL(AS1,AS2),AS of model rats (AS3) and AS of rats administrated with cyclophosphamide, were prepared first.The effects of QQOL on passive cutaneous anaphylaxis (PCA) of normal rats injected with various types of AS, on PCA of rats in the treatment and control groups injected with AS3 and on the indirect release of histamine of celiac mastocyte were observed.The results showed that:(1) the absorption value of skin graft infusion of normal rats injected with AS1 and AS2 was lowered markedly(P<0.01 or P<0.001) as compared with that of rats injected with AS3;(2) After injection of AS3,the absorption value of rats in the treatment groups (with high and low dosages of QQOL respectively) was also lowered markedly (P<0.05) as compared with that in the normal group;(3)Indirect release of histamine of celiac mastocyte was inhibited in rats sensitized by Radix Trichosanthis (P<0.01) as compared with that in the control group. It is suggested that QQOL possesses an antagonistic effect on Type I allergy and this will supply a certain immunopharmacological basis for the treatment of wind-heat type throat itching and cough.
, http://www.100md.com
Key words:@QUFENG QINGFEI ORAL LIQUID/ther.use; GOUGH/TCD ther.; DISPELLING WIND;
CLEARING LUNG; HYPERSENSITIVITY,IMMEDIATE/immunology; MAST CELLS/drug eff.;
HISTAMINE LIBERATION/drug eff.
临床上外感风热咳嗽病人多伴有喉痒，但这未引起足够重视。笔者认为，外感风热是“风热喉痒咳嗽”发生的直接原因；结合现代医学研究，该病多有过敏因素存在，与Ⅰ型变态反应有关。用祛风清肺口服液治疗该病，取得良好疗效[1]。本文研究该口服液的抗Ⅰ型变态反应作用，以探讨其作用机理。
1 实验材料
, 百拇医药
1.1 药物及主要试剂
祛风清肺口服液(由麻黄、甘草、桃仁、桔梗、蝉蜕、石膏、大枣等组成)由广州中医药大学第一附属医院制剂室提供，生药含量1.93 kg/L，批号951023。组织胺：中科院生物化学所提供，批号911108。OPT(邻苯二甲醛)： Fluka 产品。伊文思蓝：上海化学试剂采购供应站进口分装。抗原：天花粉(1989年粗品，广东省药物研究所提供)。佐剂：市售4%氢氧化铝凝胶，用时以 500 mg 天花粉粗品溶于 60 mL 氢氧化铝凝胶中(含天花粉粗品 8.3 g/L)。
1.2 动物
SD 系大白鼠由广东省卫生厅医用动物场购入(合格证号：96A02)。
1.3 仪器
上海第三分析仪器厂生产的 722 型光栅分光光度计；日本岛津RF-510荧光分光光度计。
, http://www.100md.com
2 实验方法
2.1 祛风清肺口服液对大鼠被动皮肤过敏反应实验(PCA)[2]
2.1.1 抗血清的制备 选健康SD大白鼠20只，体重100～200 g，随机分为5组。除正常对照组外，每只大鼠双前肢皮下注射天花粉粗品氢氧化铝混悬液共0.4 mL。 3 d后，双后肢再同样免疫1次。同时，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺溶液 70 mg/kg；其余各组灌胃给药：祛风清肺口服液低剂量组(简称低剂量组，11.6 g/kg)、祛风清肺口服液高剂量组(简称高剂量组，23.2 g/kg)、正常组与模型组(天花粉致敏但未灌服中药)给予等量的生理盐水。第1次免疫后 15 d，各组大鼠颈动脉放血处死，离心得抗血清，并将每组中各个大鼠血清混合。
2.1.2 PCA预试 选大鼠4只，体重 150～200 g，剪去背部的毛，背部每点分别按下列浓度皮内注射模型组混合抗血清 0.1 mL (1∶1、1∶10、1∶20、1∶40)， 48 h 后进行抗原攻击，股静脉注射天花粉粗品 10 mg/kg (天花粉粗品用 1% 伊文思蓝溶液配成 1 mg/kg)。 20 min 后断头处死动物，翻转背部皮肤，观察效价。结果发现抗血清(1∶1、1∶10)注射点处有明显蓝斑。
, 百拇医药
2.1.3 PCA正式实验
2.1.3.1 各组大鼠抗血清对正常大鼠皮肤PCA的影响 选大鼠 40只，均分为 5 组。各组大鼠背部每点各皮内注射 0.1 mL所制备的混合抗血清。 48 h 后，同预试中方法攻击， 20 min 后，断头处死动物，剪开皮片观察，并用直径 10 mm 打孔器取下皮片，剪碎，加入 3 mL 丙酮-生理盐水(7∶3)混合溶液，浸泡过夜，3 000 r/min离心 10 min ，取上清液，用 722 型分光光度计在波长 610 nm 处测光密度(D，原称OD值)。
2.1.3.2 模型组抗血清对不同组大鼠皮肤PCA的影响 选大鼠 32 只，均分为 4 组。阳性对照组腹腔注射酮替芬 7.5 mg/kg，高、低剂量组灌胃给药，药量同前，正常组予等量生理盐水。大鼠背部每点各皮内注射 0.1 mL所制备的模型组混合抗血清。48 h后，同预试中方法攻击，仅阳性药物组在攻击前，用大鼠另一条股静脉注射酮替酚溶液 7.5 mg/kg，20 min后，断头处死动物，剪开皮片观察，其余步骤同2.1.3.1。
, 百拇医药
2.2 祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组织胺(histamine)的实验
2.2.1 大鼠腹腔肥大细胞释放组胺试验[3]取健康 SD 大白鼠4只，体重 150～220 g，雌雄各半。处死后腹腔注射台氏液(Tyrod's液，无钙，37℃) 10 mL/只，轻揉 90 次，吸出全部腹腔液于含 5 U肝素的 10 mL试管中，置水浴中，4℃，600 r/min离心 15 min，倾去上清，用冷 Tyrod's液再洗1次，同样离心，4管合并，以 7.0 mL Tyrod's液悬起细胞。在冰浴中将上述肥大细胞悬液(0.1 mL/管)、模型组混合抗血清(0.1 mL/管)分别加入各组小试管中，其中口服液(低)组已加入药物0.1 mL(1.93 kg/L)、口服液(高)组已加入药物0.1 mL(3.86 kg/L)、阳性药物组已加入酮替芬 0.1 mL (0.1 g/L)，正常对照组予0.1 mL生理盐水。孵育 5 min，摇匀，每管加天花粉 (10 g/L)0.1 mL。然后，置 37℃温育 15 min，立即置冰浴中中止反应。 4℃?2?500 r/min离心 20 min，分出上清和细胞沉淀。分别提取细胞内、外的组胺。上清中加 0.1 mol/L HCl 0.1 mL 煮沸 5 min，2?500 r/min，离心 15 min，取上清用于测定细胞外组胺；往细胞沉淀中加入 1.0 mL 生理盐水和 0.1 mol/L HCl 0.1 mL，亦煮沸 5 min，2?500 r/min离心 15 min，取上清用于测定细胞内组胺。每个数据均为平行复管的平均数。按下式计算组胺释放率(p释放)和抑制率(p抑制)。
, 百拇医药
2.2.2 组胺测定 按文献[4]方法处理样本，用荧光分光光度仪(岛津RF-510型)在发射波长 448 nm，荧光波长 350 nm处测定各管荧光强度(fluorescence intensity ,FI)。
2.2.3 Histamine 标准曲线 称组胺11.1 mg于100 mL0.1mol/L HCl中，形成10-3 mol/L组胺，然后吸0.1 mL于 100 mL 0.1 mol/L HCl中 ，形成10-6 mol/L(即含111 μg/L)，以后对半稀释，测出对应荧光强度(Y)。回归直线方程为：
Y=4.172+0.593X，r=0.998
3 结果
3.1 各组大鼠抗血清对正常大鼠皮肤PCA的影响
, http://www.100md.com
表1结果显示，祛风清肺口服液低、高剂量、阳性药物对照组混合抗血清注射点皮片浸液的吸光度值比模型组降低(P<0.01或P<0.001)。
表1 给药组大鼠混合抗血清与模型组大鼠混合抗血清对正常大鼠PCA的影响 组 别
N/只
D/(
)模型组
8
0.176±0.036
阳性药物组
8
, http://www.100md.com
0.078±0.004**
高剂量组
8
0.041±0.006**
低剂量组
8
0.123±0.015*
统计方法：t检验(下同)； * 与模型组比较，P<0.01， ** P<0.001
3.2 模型组抗血清对各组大鼠皮肤PCA的影响
表2显示，祛风清肺口服液低、高剂量组大鼠注射点的皮片浸液光密度值比正常组降低(P<0.05)，表明祛风清肺口服液对天花粉致敏的大鼠被动皮肤过敏反应有抑制作用。
, 百拇医药
3.3 祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组织胺的影响
表2 模型组抗血清对各组大鼠PCA的影响 组 别
N/只
Q剂量/(g.kg-1)
D/(
)正常对照组
8
0.176±0.036
口服液(低)组
, 百拇医药 8
11.6
0.100±0.045*
口服液(高)组
8
23.2
0.089±0.057*
酮替芬组
8
7.5×10-3
0.019±0.006**
, 百拇医药 * 与正常对照组比较，P<0.05， ** P<0.001
3.3 祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组织胺的影响
表3结果显示，祛风清肺口服液低、高剂量组均可抑制大鼠腹腔肥大细胞间接释放组胺，与正常对照组相比，P<0.01；口服液高剂量组与阳性药物组比较，差异无显著性(P>0.05)。
表3 祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组胺的影响 组 别
p释放/(
)%p抑制/%
正常对照组
, 百拇医药
47.03±1.51
口服液(低)组
30.01±3.72*△
38.19
口服液(高)组
22.98±2.63*
51.14
酮替芬组
25.68±2.75*
45.39
* 与对照组比较，P<0.01； △ 与酮替芬组比较，P<0.05
, http://www.100md.com
4 讨论
4.1 祛风清肺口服液治疗风热喉痒咳嗽的可能机理
I型变态反应是由IgE抗体介导的速发型反应。我们曾用放免法(按天津德普生物技术和医学产品有限公司出品的总IgE免疫放射检测试剂盒说明书的操作步骤进行)测定各组大鼠抗血清、以及正常大白鼠血清中的总IgE的含量，结果发现各组的测定值之间无显著性差异(P>0.05)，说明天花粉致敏后的大鼠血清总IgE的含量并无明显升高。而吴氏[5]的实验证明，天花粉致敏大鼠后产生抗天花粉特异性IgE抗体。从表2可以看出，祛风清肺口服液低、高剂量组、阳性药物对照组混合抗血清注射点皮片浸液的吸光度值降低(P<0.01或P<0.001)。而介导 24～72 h 的PCA反应的是致敏大鼠血清中特异性的IgE抗体，这表明祛风清肺口服液可能是通过减少抗天花粉特异性IgE抗体的产生从而抗I型变态反应的。
组织胺预先储存在组织的肥大细胞和血液中的嗜碱性粒细胞中，是抗原刺激致敏机体后，肥大细胞释放出来的最主要的生物活性物质。我们采用组织胺荧光测定法[4]测定祛风清肺口服液对大鼠腹腔肥大细胞间接释放组胺的影响。该法是利用组织胺可与邻苯二甲醛(OPT)发生缩合反应，生成带有荧光的缩合物的原理。先将组织胺提取到正丁醇中，然后在荧光比色计上测定。实验结果发现：经抗原刺激后，正常组大鼠组织胺释放率为(47.03±1.51)%，经祛风清肺口服液保护后，仅有少量组织胺释放(P<0.01)。说明祛风清肺口服液确有保护肥大细胞，抑制组胺释放从而抗Ⅰ型变态反应的作用。
, http://www.100md.com
在Ⅰ型变态反应的效应阶段，释放出的生物活性介质均能使皮肤局部血管的通透性增加。被动皮肤过敏反应试验(PCA)结果发现：祛风清肺口服液低、高剂量组大鼠皮片D值(即OD值)比正常组降低(P<0.05)，表明该药能抑制PCA反应引起的血管通透性增加与炎症渗出。
以上可能是祛风清肺口服液在Ⅰ型变态反应发生的不同阶段抗过敏反应的机理，也可能是该药治疗“风热喉痒咳嗽”的免疫药理学基础。
4.2 方法学的问题
用天花粉作为抗原引起大鼠过敏模型的浓度多为2.5 g/L左右[5]，而我们所用的天花粉为广东省药物研究所提供的1989年的天花粉粗品，效价可能有所降低，故所配浓度较常用天花粉浓度高。
基金项目：广州中医药大学课题，课题号C96-22
, http://www.100md.com 作者简介：胡学军，男，硕士研究生，药师
参考文献：
[1] 骆和生，苏雪英.喉痒咳嗽213例证治分析[J].中国医药学报，1989，4(4)：33
[2] 李仪奎主编.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1996.449
[3] 殷凯生.一种改良的嗜碱细胞组胺释放试验[J].中华微生物学和免疫学杂志，1983，3(6)：362
[4] 窦淑筠，符云峰.血及组织中组胺的荧光测定法[J].中华医学检验杂志，1981，4(2)：100
[5] 吴若钅 术，张淑敏，马佳雯，等.天花粉引起被动肺过敏的大鼠模型[J].中国药理学报，1985，3(1)：68
[6] 谭生建，王 琰，刘 刚，等.补骨脂酊中补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱测定法[J].中国中药杂志，1995，20(2)：99
收稿日期：1998-10-09, 百拇医药