33．5KDa胆汁泡蛋白促成核活性及其对泡形态学影响的研究*
作者：项建斌 蔡端 张延龄 马保金
单位：上海医科大学附属华山医院普外科(200040)
关键词：胆汁泡；胆汁泡蛋白；促成核因子
肝胆胰外科杂志990105 摘要 目的：探讨33.5KDa泡蛋白在胆固醇成核过程中的作用。方法：利用超速离心技术结合PAGE电泳及区带定位法制备33.5KDa泡蛋白；并将其加入Small模拟胆汁及综合模拟胆汁作为试验组，相应地以人体白蛋白为对照组，用偏光显微镜观察胆固醇成核时间，在透射电镜下观察模拟胆汁泡的大小、形态及数量。结果：Small试验组成核时间为3.83±0.31天，对照组为12.33±0.56天(P<0.001)；综合试验组平均成核时间为3.17±0.17天，而对照组长达10.33±0.21天(P<0.001)。随着时间的推移，Small试验组及综合试验组泡逐渐增大、聚集、融合，最终形成巨大复层泡。两组均较相应的对照组变化显著(P<0.05)。结论：33.5kDa泡蛋白具有很强的促进泡形成、聚集，融合及胆固醇单水结晶析出的作用(成核活性约为0.310)。
, 百拇医药
The potent cholesterol-nucleation-promoting activity and morphometric effect on the model biliary vesicles of 33.5KDa visicular protein
Xiang Jianbin,Cai Duan,Zhang Yanling,etal
Huashan Hospital,Shanghai 200040
Abstract Objective：To examine the role of 33.5KDa visicular protein in cholesterol nucleation process.Methods:Compare albymin with the vesicular protein mixd with small artificial modle bile or synthetic artifical modle bile or synthetic artificial modle bile respectively.All bile samples were examined by polarizing microscopy to detect nuclation time,and to observe size,figure and qrantity of model biliary velicles under transmission electron microscopy.Results:33.5KDa vesiculr protein shortened the nucleation time of cholesterol monohydrate crystals when added to small artificial mode bile or synthetic artificial modle bile,while albumin did not.(3.83±0.13vs 12.33±0.56days,3.17±0.17vs 10.33±0.21days respectively,P<0.001).Furthermore,a strikingly rapid dnovo formation of unilamellar vesicles was found,Soon followed by massive vesicular aggregation,culmiinate in the two different artificial modle biles.Conclusions:These data suggest that 33.5KDa vesicular proteins play an important role in vesicle formation aggregation and fusion and accelerate the rate of formation of soid cholesterol crystals and thus may help to promote spontaneous cholesterol gallstone foramtion in humans.
, 百拇医药
Key words Vesicles Vesicular proteins Nnucleating proteins
胆汁中胆固醇-磷脂泡(以下简称泡)的聚集和融合是胆固醇成核的重要环节。研究泡中存在的少量蛋白(以下简称泡蛋白)对泡形成和发展的影响，对探讨胆石成因有重要意义。我们曾利用超速离心技术结合PAGE电泳及区带定位法，首次在人胆汁中提纯到一种分子量为33.5kDa的泡蛋白[1]。本文旨在研究该蛋白质的成核活性及其对泡形态学的影响。
1材料和方法
1.1 材料：甲泛蒲胺，PAGE电泳试剂丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基乙二胺、过硫酸铵、溴酚蓝、考马斯亮蓝R250以及配制模拟胆汁的胆固醇、脱氧牛磺胆酸钠、卵磷脂、Tris等均购自Sigma公司。胆红素IX购自Fluka公司。低分子量标准蛋白质购自上海生化所东风试剂厂。其余均用市售分析纯试剂。超速离心机(VTi垂直转头，BeckmanCo)；框式夹板式电泳槽(上海精益仪器厂)；偏光显微镜(OlympusCo)；JEM-1200EX电镜(日本电子公司)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 模拟胆汁制备：参照改良的Kibe法[2]制备Small模拟胆汁，控制总脂浓度为100g/L，胆盐 磷脂比为4，CSI分别为1.0及1.2；另按朱氏设计的方法配制综合模拟胆汁[3]，其中未结合胆红素饱和浓度分别为3.99mmol/L及3.80mmol/L。所用缓冲液为Tris-HCl(20mmol/L，pH7.4)。
1.2.2 33.5kDa泡蛋白的制备及定量：根据改良的Miquel超速离心法[4]提取胆汁泡。
PAGE电泳参照Davis法[5]，其中浓缩胶、分离胶浓度分别为5%、10%，用考马斯亮蓝R250染色。根据染色凝胶的蛋白区带位置，切取未染色凝胶相应的33.5kDa蛋白质区带，电透析过夜，脱盐并冻干后备用。按Lowry法测定胆汁总蛋白及胆汁泡蛋白含量。
, 百拇医药
1.2.3 33.5kDa泡蛋白成核活性检测：1mlSmall模拟胆汁及综合模拟胆汁(CSI1.2)中分别加入40g33.5kDa泡蛋白作为试验组，相应的对照组用人体白蛋白，共分四组。成核时间(NT)的测定根据Holan法[6]。
1.2.4 33.5kDa泡蛋白对模拟胆汁泡形态学的影响：试验组每份取20μg33.5kDa泡蛋白与1ml模拟胆汁(CSI1.0)混匀，置入37℃恒温箱培养。当时、1天、3天、5天、7天、9天后各取20μl作透镜电镜(磷钨酸负染，铜网)观察泡的直径(郑氏法[7]，以每张照片最大及最小5个泡的平均值表示)、形态及数量(取每张铜网的5个网格泡数量平均数)。
统计学处理：数据均用
±s表示。采用SAS统计软件包统计分析，检验水平α＝0.05。
2结果
, http://www.100md.com
2.1 人胆汁33.5kDa泡蛋白的定量：200mlT管胆汁经密度梯度超速离心后分为三层，上层为乳白色胆汁泡。测得泡蛋白的浓度为0.46±0.06mg/ml，原始胆汁蛋白浓度为7.53±0.93mg/ml。据推算33.5kDa泡相蛋白约占胆汁总蛋白的0.552%。
2.2 33.5kDa泡蛋白成核活性检测：由表1可见，在Small模拟胆汁试验组平均成核时间为3.83±0.31天，而对照组为12.33±0.56天，两者差异显著(P<0.001)，提示该蛋白质有较强促成核作用，其成核活性为0.310；在含未结合胆红素的综合模拟胆汁中，试验组成核时间为3.17±0.17天，较对照组(10.33±0.21天)明显缩短(P<0.001)，该蛋白的成核活性为0.306，与在Small模拟胆汁体系中基本一致。
2.3 33.5kDa泡蛋白对模拟胆汁泡形态学的影响：在Small模拟胆汁体系中研究发现：随着时间为推移，试验组中单层小泡逐渐增大成为大泡，进一步发生聚集和融合，随即观察到复层泡的出现；且时间越久，复层泡也渐趋增大，数量也逐渐增多，最终聚集和融合成巨大复合泡。在综合模拟胆汁体系中也观察到类似的变化，但比Small模拟胆汁体系中泡的增大速度要快，复层泡亦较早较多出现。两组均较相应的对照组变化明显(P<0.05)(图1～3，表1、表2)。
, http://www.100md.com
表1 33.5kd泡蛋白对模拟胆汁单层泡形态学影响的电镜观察(
±s，n＝6) 直径
(nm)
观察时间
0
1
3
5
7
9
Small试验组
64.16±5.19
, 百拇医药
252.33±33.31
370.00±7.55
46.16±57.50
4877.67±84.36
924.16±105.25
Small对照组
58.03±7.11
88.33±4.73
199.67±1.95
317.00±5.72
441.16±67.63
, http://www.100md.com
723.67±75.40
综合试验组
67.25±4.24
173.83±7.25
302.67±16.04
358.16±71.13
704.67±63.81
798.33±83.64
综合对照组
60.83±5.29
72.67±11.59
, 百拇医药
97.00±11.14
185.33±87.12
383.33±63.50
633.00±49.76
表2 33.5kd泡蛋白对模拟胆汁复层泡形态学影响的电镜观察(
±,，n＝6)
直径
(nm)
观察时间
0
1
, http://www.100md.com
3
5
7
9
Small试验组
-
-
62.67±26.73
425.00±45.21
794.33±94.71
888.00±177.97
Small对照组
, 百拇医药 -
-
-
-
113.33±36.12
209.33±7.51
综合试验组
-
39.66±1.73
182.00±49.11
570.60±265.95
919.00±246.87
, http://www.100md.com
1097.33±217.66
综合对照组
-
-
-
41.67±9.07
177.67±19.66
601.33±25.97
注：“-”示未观察到复层泡
, 百拇医药
附图 综合实验组胆汁体系变化(80.0kv×30k200nm)
①即刻示单层小泡 ②3天后示单层泡聚集,复层泡开始出现 ③7天后示复层泡融合
3讨论
胆固醇成核是胆固醇结石形成的关键步骤。胆汁中促、抗成核因子在胆固醇结石成核过程中的作用是近年来胆道外科基础研究的热点之一。我们结合超速离心法及PAGE电泳区带定位法，在胆固醇结石患者胆汁中分离和纯化到一种分子量为33.5kDa的泡蛋白。测定其蛋白浓度为0.46±0.06mg/ml，约占胆汁总蛋白量的0.552%。尽管33.5kDa泡蛋白含量甚微，却具有显著的促成核作用(成核活性0.310)，明显强于以前发现的70kDa[8](成核活性0.564)，130kDa[9，10](成核活性0.419)和200kDa糖蛋白[11](成核活性0.356)。寻找强促成核活性蛋白，建立酶联免疫检测(ELISA)法，用于预测胆结石患者发病趋势和评估临床药物等治疗效果，筛选有效的溶石方法，从根本上防止胆固醇结石的产生和复发是我们研究胆石成因的最终目的。
, 百拇医药
不同的模拟胆汁体系(Small体系和综合体系)中，当总脂浓度、胆固醇饱和指数、pH、胆盐/磷脂比等一致时，33.5kDa泡蛋白促成核活性大体相同，分别为0.310、0.306。提示该蛋白的促成核作用可能与其本身结构中固有的氨基酸组成有关，但其确切的作用机理仍有待今后深入阐述。综合模拟胆汁试验组、对照组成核时间均较相应的Small试验组、对照组核时间缩短，提示未结合胆红素在饱和 过饱和模拟胆汁中可能起促进胆固醇成核的作用。这一现象可用“空格占位”假说[12]解释。本研究两组间均未达到统计学检验水平(P＝0.056)，可能与样本含量过少有关。未结合胆红素与胆固醇成核的关系尚需进一步研究与探讨。
*本课题受国家自然基金资助(批准号39570695)
参考文献
1 马保金，蔡端，张延龄.胆汁成核活性的研究.中华肝胆外科杂志，1998，4(2)∶45～47
, http://www.100md.com
2 Kibe A，Holzbach RT，LaRusso NF etal.Inhibition of cholesterol crystal formation by apolipoprote in sinsupersaturated model bile，Science，1984，255∶514
3 朱雷明，蔡端，张延龄.在模拟胆汁体系中游离胆红素的热力学研究.外科理论与实践，1999，4(1)∶1～5
4 Miquel JF，Rigotti Rojas.AE etal.Isolation and purification of human bil-iary vesicles with potent cholesterol-nucleation-promotingac-tivity.ClinicalScience1992；82∶175～180
5 Davis BJ.Disc electrophoresis Ⅱ Methods and applica tionto human serum proteins.Ann NY Acad Sci，1964；121∶404
, 百拇医药
6 Holan KR，Holzbach RT，Hermann RE etal.Nucleation time：a key factor in the path ogenesis of cholesterol gallstone disease.Gastroenterology，1979；77∶611～617
7 郑富盛.细胞颗粒平均外切直径与数密度的测算.生物物理学学报，1986，2∶372～379
8 焦宛，张延龄，蔡端.胆汁中促成核糖蛋白的分离、提纯及理化性质研究.中华外科杂志，1994，5∶271～274
9 陈雨强，张延龄，蔡端.成核效应蛋白在泡凝聚融合过程中作用的初步研究.中华外科杂志，1997，3∶181～185
10 Groen AK，Noordam C，Drapers AG，etal.Isolation of a potent cholesterol nucleation-promoting activity from human gall-bladderbile：role in the pathogensis of gallstone disease.Hepa-tology.1989，11∶525～533
11 蔡端，励峰，张延龄.胆汁中促成核糖蛋白的检测及临床应用.中华医学杂志，1997；77∶467～468
12 蔡端，张延龄，邬建国.胆汁中胆固醇和胆红素含量相关性研究.
上海医学，1989；12∶709～711
(收稿：1998-06-17), http://www.100md.com
单位：上海医科大学附属华山医院普外科(200040)
关键词：胆汁泡；胆汁泡蛋白；促成核因子
肝胆胰外科杂志990105 摘要 目的：探讨33.5KDa泡蛋白在胆固醇成核过程中的作用。方法：利用超速离心技术结合PAGE电泳及区带定位法制备33.5KDa泡蛋白；并将其加入Small模拟胆汁及综合模拟胆汁作为试验组，相应地以人体白蛋白为对照组，用偏光显微镜观察胆固醇成核时间，在透射电镜下观察模拟胆汁泡的大小、形态及数量。结果：Small试验组成核时间为3.83±0.31天，对照组为12.33±0.56天(P<0.001)；综合试验组平均成核时间为3.17±0.17天，而对照组长达10.33±0.21天(P<0.001)。随着时间的推移，Small试验组及综合试验组泡逐渐增大、聚集、融合，最终形成巨大复层泡。两组均较相应的对照组变化显著(P<0.05)。结论：33.5kDa泡蛋白具有很强的促进泡形成、聚集，融合及胆固醇单水结晶析出的作用(成核活性约为0.310)。
, 百拇医药
The potent cholesterol-nucleation-promoting activity and morphometric effect on the model biliary vesicles of 33.5KDa visicular protein
Xiang Jianbin,Cai Duan,Zhang Yanling,etal
Huashan Hospital,Shanghai 200040
Abstract Objective：To examine the role of 33.5KDa visicular protein in cholesterol nucleation process.Methods:Compare albymin with the vesicular protein mixd with small artificial modle bile or synthetic artifical modle bile or synthetic artificial modle bile respectively.All bile samples were examined by polarizing microscopy to detect nuclation time,and to observe size,figure and qrantity of model biliary velicles under transmission electron microscopy.Results:33.5KDa vesiculr protein shortened the nucleation time of cholesterol monohydrate crystals when added to small artificial mode bile or synthetic artificial modle bile,while albumin did not.(3.83±0.13vs 12.33±0.56days,3.17±0.17vs 10.33±0.21days respectively,P<0.001).Furthermore,a strikingly rapid dnovo formation of unilamellar vesicles was found,Soon followed by massive vesicular aggregation,culmiinate in the two different artificial modle biles.Conclusions:These data suggest that 33.5KDa vesicular proteins play an important role in vesicle formation aggregation and fusion and accelerate the rate of formation of soid cholesterol crystals and thus may help to promote spontaneous cholesterol gallstone foramtion in humans.
, 百拇医药
Key words Vesicles Vesicular proteins Nnucleating proteins
胆汁中胆固醇-磷脂泡(以下简称泡)的聚集和融合是胆固醇成核的重要环节。研究泡中存在的少量蛋白(以下简称泡蛋白)对泡形成和发展的影响，对探讨胆石成因有重要意义。我们曾利用超速离心技术结合PAGE电泳及区带定位法，首次在人胆汁中提纯到一种分子量为33.5kDa的泡蛋白[1]。本文旨在研究该蛋白质的成核活性及其对泡形态学的影响。
1材料和方法
1.1 材料：甲泛蒲胺，PAGE电泳试剂丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基乙二胺、过硫酸铵、溴酚蓝、考马斯亮蓝R250以及配制模拟胆汁的胆固醇、脱氧牛磺胆酸钠、卵磷脂、Tris等均购自Sigma公司。胆红素IX购自Fluka公司。低分子量标准蛋白质购自上海生化所东风试剂厂。其余均用市售分析纯试剂。超速离心机(VTi垂直转头，BeckmanCo)；框式夹板式电泳槽(上海精益仪器厂)；偏光显微镜(OlympusCo)；JEM-1200EX电镜(日本电子公司)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 模拟胆汁制备：参照改良的Kibe法[2]制备Small模拟胆汁，控制总脂浓度为100g/L，胆盐 磷脂比为4，CSI分别为1.0及1.2；另按朱氏设计的方法配制综合模拟胆汁[3]，其中未结合胆红素饱和浓度分别为3.99mmol/L及3.80mmol/L。所用缓冲液为Tris-HCl(20mmol/L，pH7.4)。
1.2.2 33.5kDa泡蛋白的制备及定量：根据改良的Miquel超速离心法[4]提取胆汁泡。
PAGE电泳参照Davis法[5]，其中浓缩胶、分离胶浓度分别为5%、10%，用考马斯亮蓝R250染色。根据染色凝胶的蛋白区带位置，切取未染色凝胶相应的33.5kDa蛋白质区带，电透析过夜，脱盐并冻干后备用。按Lowry法测定胆汁总蛋白及胆汁泡蛋白含量。
, 百拇医药
1.2.3 33.5kDa泡蛋白成核活性检测：1mlSmall模拟胆汁及综合模拟胆汁(CSI1.2)中分别加入40g33.5kDa泡蛋白作为试验组，相应的对照组用人体白蛋白，共分四组。成核时间(NT)的测定根据Holan法[6]。
1.2.4 33.5kDa泡蛋白对模拟胆汁泡形态学的影响：试验组每份取20μg33.5kDa泡蛋白与1ml模拟胆汁(CSI1.0)混匀，置入37℃恒温箱培养。当时、1天、3天、5天、7天、9天后各取20μl作透镜电镜(磷钨酸负染，铜网)观察泡的直径(郑氏法[7]，以每张照片最大及最小5个泡的平均值表示)、形态及数量(取每张铜网的5个网格泡数量平均数)。
统计学处理：数据均用
±s表示。采用SAS统计软件包统计分析，检验水平α＝0.05。2结果
, http://www.100md.com
2.1 人胆汁33.5kDa泡蛋白的定量：200mlT管胆汁经密度梯度超速离心后分为三层，上层为乳白色胆汁泡。测得泡蛋白的浓度为0.46±0.06mg/ml，原始胆汁蛋白浓度为7.53±0.93mg/ml。据推算33.5kDa泡相蛋白约占胆汁总蛋白的0.552%。
2.2 33.5kDa泡蛋白成核活性检测：由表1可见，在Small模拟胆汁试验组平均成核时间为3.83±0.31天，而对照组为12.33±0.56天，两者差异显著(P<0.001)，提示该蛋白质有较强促成核作用，其成核活性为0.310；在含未结合胆红素的综合模拟胆汁中，试验组成核时间为3.17±0.17天，较对照组(10.33±0.21天)明显缩短(P<0.001)，该蛋白的成核活性为0.306，与在Small模拟胆汁体系中基本一致。
2.3 33.5kDa泡蛋白对模拟胆汁泡形态学的影响：在Small模拟胆汁体系中研究发现：随着时间为推移，试验组中单层小泡逐渐增大成为大泡，进一步发生聚集和融合，随即观察到复层泡的出现；且时间越久，复层泡也渐趋增大，数量也逐渐增多，最终聚集和融合成巨大复合泡。在综合模拟胆汁体系中也观察到类似的变化，但比Small模拟胆汁体系中泡的增大速度要快，复层泡亦较早较多出现。两组均较相应的对照组变化明显(P<0.05)(图1～3，表1、表2)。
, http://www.100md.com
表1 33.5kd泡蛋白对模拟胆汁单层泡形态学影响的电镜观察(
±s，n＝6) 直径(nm)
观察时间
0
1
3
5
7
9
Small试验组
64.16±5.19
, 百拇医药
252.33±33.31
370.00±7.55
46.16±57.50
4877.67±84.36
924.16±105.25
Small对照组
58.03±7.11
88.33±4.73
199.67±1.95
317.00±5.72
441.16±67.63
, http://www.100md.com
723.67±75.40
综合试验组
67.25±4.24
173.83±7.25
302.67±16.04
358.16±71.13
704.67±63.81
798.33±83.64
综合对照组
60.83±5.29
72.67±11.59
, 百拇医药
97.00±11.14
185.33±87.12
383.33±63.50
633.00±49.76
表2 33.5kd泡蛋白对模拟胆汁复层泡形态学影响的电镜观察(
±,，n＝6)直径
(nm)
观察时间
0
1
, http://www.100md.com
3
5
7
9
Small试验组
-
-
62.67±26.73
425.00±45.21
794.33±94.71
888.00±177.97
Small对照组
, 百拇医药 -
-
-
-
113.33±36.12
209.33±7.51
综合试验组
-
39.66±1.73
182.00±49.11
570.60±265.95
919.00±246.87
, http://www.100md.com
1097.33±217.66
综合对照组
-
-
-
41.67±9.07
177.67±19.66
601.33±25.97
注：“-”示未观察到复层泡
, 百拇医药
附图 综合实验组胆汁体系变化(80.0kv×30k200nm)
①即刻示单层小泡 ②3天后示单层泡聚集,复层泡开始出现 ③7天后示复层泡融合
3讨论
胆固醇成核是胆固醇结石形成的关键步骤。胆汁中促、抗成核因子在胆固醇结石成核过程中的作用是近年来胆道外科基础研究的热点之一。我们结合超速离心法及PAGE电泳区带定位法，在胆固醇结石患者胆汁中分离和纯化到一种分子量为33.5kDa的泡蛋白。测定其蛋白浓度为0.46±0.06mg/ml，约占胆汁总蛋白量的0.552%。尽管33.5kDa泡蛋白含量甚微，却具有显著的促成核作用(成核活性0.310)，明显强于以前发现的70kDa[8](成核活性0.564)，130kDa[9，10](成核活性0.419)和200kDa糖蛋白[11](成核活性0.356)。寻找强促成核活性蛋白，建立酶联免疫检测(ELISA)法，用于预测胆结石患者发病趋势和评估临床药物等治疗效果，筛选有效的溶石方法，从根本上防止胆固醇结石的产生和复发是我们研究胆石成因的最终目的。
, 百拇医药
不同的模拟胆汁体系(Small体系和综合体系)中，当总脂浓度、胆固醇饱和指数、pH、胆盐/磷脂比等一致时，33.5kDa泡蛋白促成核活性大体相同，分别为0.310、0.306。提示该蛋白的促成核作用可能与其本身结构中固有的氨基酸组成有关，但其确切的作用机理仍有待今后深入阐述。综合模拟胆汁试验组、对照组成核时间均较相应的Small试验组、对照组核时间缩短，提示未结合胆红素在饱和 过饱和模拟胆汁中可能起促进胆固醇成核的作用。这一现象可用“空格占位”假说[12]解释。本研究两组间均未达到统计学检验水平(P＝0.056)，可能与样本含量过少有关。未结合胆红素与胆固醇成核的关系尚需进一步研究与探讨。
*本课题受国家自然基金资助(批准号39570695)
参考文献
1 马保金，蔡端，张延龄.胆汁成核活性的研究.中华肝胆外科杂志，1998，4(2)∶45～47
, http://www.100md.com
2 Kibe A，Holzbach RT，LaRusso NF etal.Inhibition of cholesterol crystal formation by apolipoprote in sinsupersaturated model bile，Science，1984，255∶514
3 朱雷明，蔡端，张延龄.在模拟胆汁体系中游离胆红素的热力学研究.外科理论与实践，1999，4(1)∶1～5
4 Miquel JF，Rigotti Rojas.AE etal.Isolation and purification of human bil-iary vesicles with potent cholesterol-nucleation-promotingac-tivity.ClinicalScience1992；82∶175～180
5 Davis BJ.Disc electrophoresis Ⅱ Methods and applica tionto human serum proteins.Ann NY Acad Sci，1964；121∶404
, 百拇医药
6 Holan KR，Holzbach RT，Hermann RE etal.Nucleation time：a key factor in the path ogenesis of cholesterol gallstone disease.Gastroenterology，1979；77∶611～617
7 郑富盛.细胞颗粒平均外切直径与数密度的测算.生物物理学学报，1986，2∶372～379
8 焦宛，张延龄，蔡端.胆汁中促成核糖蛋白的分离、提纯及理化性质研究.中华外科杂志，1994，5∶271～274
9 陈雨强，张延龄，蔡端.成核效应蛋白在泡凝聚融合过程中作用的初步研究.中华外科杂志，1997，3∶181～185
10 Groen AK，Noordam C，Drapers AG，etal.Isolation of a potent cholesterol nucleation-promoting activity from human gall-bladderbile：role in the pathogensis of gallstone disease.Hepa-tology.1989，11∶525～533
11 蔡端，励峰，张延龄.胆汁中促成核糖蛋白的检测及临床应用.中华医学杂志，1997；77∶467～468
12 蔡端，张延龄，邬建国.胆汁中胆固醇和胆红素含量相关性研究.
上海医学，1989；12∶709～711
(收稿：1998-06-17), http://www.100md.com