一株从中国人HCVλtll基因库免疫筛选的HCV cDNA克隆
作者：戚中田 潘卫 杜平 佐藤 淳风见润 有马辉胜
单位：200433，上海，第二军医大学微生物教研室(戚中田、潘卫、杜平)；日本Toray基础研究所(佐藤淳、风见润)；日本鹿儿岛大学医学院(有马辉胜)
关键词：
中华医学杂志930516 从中国人丙型肝炎(简称丙肝)患者血浆中提取丙肝病毒(HCV)RNA，用随机引物法反转录合成cDNA，并首次构建了中国人HCV λtllDNA文库。用重组免疫筛选法从构建的基因文库中获得一长379个核苷酸的HCV阳性克隆，定名为Q379。序列分析表明：Q379位于美国原型HCV-1非结构NS5区的第7314～7695位，与HCV-1株相应序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.8%和73.8%，属HCV-Ⅱ型序列。疏水性分析证量，Q379编码的126肽具有两个亲水区。与已知的病毒基因组及人DNA序列无同源性。
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一、材料与方法
1.病毒标本：采用甲型肝炎(简称甲肝)和乙型肝炎(简称乙肝)血清标志阴性、ALT高值、HCV抗体及聚合酶链反应(PCR)法检测阳性的丙肝患者血浆或血清。
2.HCV RNA制备和cDNA合成：采用聚乙二醇(PEG 4000)-硫氰酸胍法，从病毒标本中提取HCV RNA。以纯化的HCV RNA为模板，加入随机引物、在MMLV反转录酶作用下合成第一股cDNA。然后加入Rnase H和大肠杆菌DNA多聚酶合成双股cDNA。EcoRI甲基化酶处理后用T4DNA多聚酶进行cDNA末端修复。
3.HCV cDNAλtll基因文库构建：将末端修复的HCVcDNA两端加上EcoRI人工接头，经EcoRI酶切及柱层析纯化后，与λtll噬菌体DNA臂连接(Lac Z启动子的下游)，并进行体外包装，形成具有感染性的噬菌体感染大肠杆菌Y1090菌株。接种软琼脂平板，于43℃诱导空斑形成，37℃时以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导插入序列的表达。
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4.HCV cDNA文库的免疫筛选及特异性实验：将空斑表达产物由琼脂平板转移到硝酸纤维素膜上，与丙肝血清和HRP标记的羊抗人IgG反应，后经底物显色选出阳性空斑。将阳性空斑的表达产物转移到硝酸纤维膜上进行特异性鉴定。
5.阳性cDNA克隆的扩增及序列测定：提取噬菌体DNA，用λtll的EcoRI克隆位点两端序列作引物，以PCR法扩增特异插入片段。扩增片段经3% GTG琼脂脂糖电泳分离纯化后用Klenow片断修复，再以平端插入的方式克隆到pUC1818质粒Hinc Ⅱ位点中。用双脱氧末端中止法进行DNA序列测定。
二、结果与讨论
从1.05×108个噬斑中首先筛选到一个阳性空斑。其与91.7%的中国丙肝血清及78.5%的日本丙肝血清发生特异性反应(表1)，与中国或日本的正常人血清无反应，说明此阳性克隆与丙肝病毒感染密切相关。
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表1 阳性空斑(Q379)的特异性实验结果 组别
中国标本
日本标本
总数
阳性数
阳性率(%)
总数
阳性数
阳性率(%)
正常血清
25
0
0
, 百拇医药
10
0
0
丙肝血清
24
23
91.7
14
11
78.5
用PCR方法扩增了此λtll克隆中的插入片段，并将其亚克隆到pUC18载体上，进行酶切图谱及DNA序列分析。证明此阳性克隆序列(资料未列出)系中国人HCV基因组cDNA序列列；长379个核苷酸(Q379)；位于美国原型HCV-1〔1〕基因组核苷酸序列的第7314～7695位；属于NS5区。Q379与日本HCV-J〔2〕和BK〔3〕株在核苷酸水平同源性为89.8%和91.6%；氨基酸的同源性为96.6%和96.0%，而与美国原型HCV-1相应序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.8%和73.8%(表2)。根据Houghtom等的分型，Q379 与日本HCV-J和HCV-BK株同属于HCV Ⅱ组〔4〕。
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表2 Q379与日本及美国HCV株相应序列的同源性*(%) 克隆株
Q379
HCV-J
HCV-BK
HCV1
nt
aa
nt
aa
nt
aa
nt
, 百拇医药
aa
Q39
-
-
89.8
96.6
91.6
96.0
72.8
73.8
HCV-J
-
-
, http://www.100md.com
90.6
93.7
70.7
72.2
HCV-BK
70.4
73.0
HCV-1
-
-
*nt为核苷酸同源性,aa为氨期酸同源性
比较编辑子中各位置的突变频率，表明Q379与日本株HCV-J和HCV-BK的变异发生在第三位核苷酸的频率为81.6%和80.6%，明显高于与美国HCV-1株编码子中第三位核苷酸的变异频率58.8%(表3)。编码子中第三位核苷酸的改变对氨基酸序列的影响较小，此点也证明Q379与HCV-J及HCV-BK株有更近的亲缘关系。
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表3 Q379与日本及美国相应序列的核苷酸变异在编码子各位置中的分布 编码子位置
HCV1
HCV-J
HCV-BK
变异数
%
变异数
%
变异数
%
第一位
24
, http://www.100md.com 23.5
4
10.4
4
12.9
第二位
18
17.7
3
8.0
2
6.5
第三位
60
, http://www.100md.com
58.8
31
81.6
25
80.6
合 计
102
100.0
38
100.0
31
100.0
Q379在相应于HCV-1序列的7556～7558位有三个核苷酸缺失突破。此缺失恰好是一个编码子，故没有影响HCV多蛋白的开读柜架。在HCV-1中，此编码子编码天冬酰胺(Asn N)。HCV-J和HCV-BK株DNA序列中也存在类似的缺失突变，这是否为HCV-Ⅱ组序列的共同特点，有待于进一步证实。
, http://www.100md.com
Q379是通过免疫筛选获得的，说明其编码多肽含有抗原位点序列。疏水性分析(资料未列出)表明，Q379编码的126肽有两个明显的亲水峰：分别位于第32-55位和第57-70位。亲水区段常与丙肝的抗原决定簇位点相关〔5〕，而且Q379与中国丙肝血清的阳性反应率高于日本丙肝患者(表1)，显示该克隆对我国人群HCV感染的基础与临床研究有重要意义。
参考文献
1 Choo QL, Richman KH,Han JH, et al.Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:2451.
2 Kato N, Hijikata M,Ootsuyama Y,et al.Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,87:9524.
, 百拇医药
3 Takamizawa A, Mori C, Fuke I, et al. Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers.J Virol,1991, 65:1105.
4 戚中田，潘卫，杜平.中国人丙型肝炎病毒核心基因cDNA的克隆与序列分析，第二军医大学学报，1992，13：301.
5 闻玉梅，何丽芳，李雪萍，等.用合成肽研究对丙型肝炎病毒抗原决定簇的抗体反应.上海医学，1992，15：311.
(收稿：1992-08-31 修回：1993-01-22), 百拇医药
单位：200433，上海，第二军医大学微生物教研室(戚中田、潘卫、杜平)；日本Toray基础研究所(佐藤淳、风见润)；日本鹿儿岛大学医学院(有马辉胜)
关键词：
中华医学杂志930516 从中国人丙型肝炎(简称丙肝)患者血浆中提取丙肝病毒(HCV)RNA，用随机引物法反转录合成cDNA，并首次构建了中国人HCV λtllDNA文库。用重组免疫筛选法从构建的基因文库中获得一长379个核苷酸的HCV阳性克隆，定名为Q379。序列分析表明：Q379位于美国原型HCV-1非结构NS5区的第7314～7695位，与HCV-1株相应序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.8%和73.8%，属HCV-Ⅱ型序列。疏水性分析证量，Q379编码的126肽具有两个亲水区。与已知的病毒基因组及人DNA序列无同源性。
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一、材料与方法
1.病毒标本：采用甲型肝炎(简称甲肝)和乙型肝炎(简称乙肝)血清标志阴性、ALT高值、HCV抗体及聚合酶链反应(PCR)法检测阳性的丙肝患者血浆或血清。
2.HCV RNA制备和cDNA合成：采用聚乙二醇(PEG 4000)-硫氰酸胍法，从病毒标本中提取HCV RNA。以纯化的HCV RNA为模板，加入随机引物、在MMLV反转录酶作用下合成第一股cDNA。然后加入Rnase H和大肠杆菌DNA多聚酶合成双股cDNA。EcoRI甲基化酶处理后用T4DNA多聚酶进行cDNA末端修复。
3.HCV cDNAλtll基因文库构建：将末端修复的HCVcDNA两端加上EcoRI人工接头，经EcoRI酶切及柱层析纯化后，与λtll噬菌体DNA臂连接(Lac Z启动子的下游)，并进行体外包装，形成具有感染性的噬菌体感染大肠杆菌Y1090菌株。接种软琼脂平板，于43℃诱导空斑形成，37℃时以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导插入序列的表达。
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4.HCV cDNA文库的免疫筛选及特异性实验：将空斑表达产物由琼脂平板转移到硝酸纤维素膜上，与丙肝血清和HRP标记的羊抗人IgG反应，后经底物显色选出阳性空斑。将阳性空斑的表达产物转移到硝酸纤维膜上进行特异性鉴定。
5.阳性cDNA克隆的扩增及序列测定：提取噬菌体DNA，用λtll的EcoRI克隆位点两端序列作引物，以PCR法扩增特异插入片段。扩增片段经3% GTG琼脂脂糖电泳分离纯化后用Klenow片断修复，再以平端插入的方式克隆到pUC1818质粒Hinc Ⅱ位点中。用双脱氧末端中止法进行DNA序列测定。
二、结果与讨论
从1.05×108个噬斑中首先筛选到一个阳性空斑。其与91.7%的中国丙肝血清及78.5%的日本丙肝血清发生特异性反应(表1)，与中国或日本的正常人血清无反应，说明此阳性克隆与丙肝病毒感染密切相关。
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表1 阳性空斑(Q379)的特异性实验结果 组别
中国标本
日本标本
总数
阳性数
阳性率(%)
总数
阳性数
阳性率(%)
正常血清
25
0
0
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10
0
0
丙肝血清
24
23
91.7
14
11
78.5
用PCR方法扩增了此λtll克隆中的插入片段，并将其亚克隆到pUC18载体上，进行酶切图谱及DNA序列分析。证明此阳性克隆序列(资料未列出)系中国人HCV基因组cDNA序列列；长379个核苷酸(Q379)；位于美国原型HCV-1〔1〕基因组核苷酸序列的第7314～7695位；属于NS5区。Q379与日本HCV-J〔2〕和BK〔3〕株在核苷酸水平同源性为89.8%和91.6%；氨基酸的同源性为96.6%和96.0%，而与美国原型HCV-1相应序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.8%和73.8%(表2)。根据Houghtom等的分型，Q379 与日本HCV-J和HCV-BK株同属于HCV Ⅱ组〔4〕。
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表2 Q379与日本及美国HCV株相应序列的同源性*(%) 克隆株
Q379
HCV-J
HCV-BK
HCV1
nt
aa
nt
aa
nt
aa
nt
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aa
Q39
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89.8
96.6
91.6
96.0
72.8
73.8
HCV-J
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90.6
93.7
70.7
72.2
HCV-BK
70.4
73.0
HCV-1
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*nt为核苷酸同源性,aa为氨期酸同源性
比较编辑子中各位置的突变频率，表明Q379与日本株HCV-J和HCV-BK的变异发生在第三位核苷酸的频率为81.6%和80.6%，明显高于与美国HCV-1株编码子中第三位核苷酸的变异频率58.8%(表3)。编码子中第三位核苷酸的改变对氨基酸序列的影响较小，此点也证明Q379与HCV-J及HCV-BK株有更近的亲缘关系。
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表3 Q379与日本及美国相应序列的核苷酸变异在编码子各位置中的分布 编码子位置
HCV1
HCV-J
HCV-BK
变异数
%
变异数
%
变异数
%
第一位
24
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4
10.4
4
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第二位
18
17.7
3
8.0
2
6.5
第三位
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58.8
31
81.6
25
80.6
合 计
102
100.0
38
100.0
31
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Q379在相应于HCV-1序列的7556～7558位有三个核苷酸缺失突破。此缺失恰好是一个编码子，故没有影响HCV多蛋白的开读柜架。在HCV-1中，此编码子编码天冬酰胺(Asn N)。HCV-J和HCV-BK株DNA序列中也存在类似的缺失突变，这是否为HCV-Ⅱ组序列的共同特点，有待于进一步证实。
, http://www.100md.com
Q379是通过免疫筛选获得的，说明其编码多肽含有抗原位点序列。疏水性分析(资料未列出)表明，Q379编码的126肽有两个明显的亲水峰：分别位于第32-55位和第57-70位。亲水区段常与丙肝的抗原决定簇位点相关〔5〕，而且Q379与中国丙肝血清的阳性反应率高于日本丙肝患者(表1)，显示该克隆对我国人群HCV感染的基础与临床研究有重要意义。
参考文献
1 Choo QL, Richman KH,Han JH, et al.Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:2451.
2 Kato N, Hijikata M,Ootsuyama Y,et al.Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,87:9524.
, 百拇医药
3 Takamizawa A, Mori C, Fuke I, et al. Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers.J Virol,1991, 65:1105.
4 戚中田，潘卫，杜平.中国人丙型肝炎病毒核心基因cDNA的克隆与序列分析，第二军医大学学报，1992，13：301.
5 闻玉梅，何丽芳，李雪萍，等.用合成肽研究对丙型肝炎病毒抗原决定簇的抗体反应.上海医学，1992，15：311.
(收稿：1992-08-31 修回：1993-01-22), 百拇医药