低密度脂蛋白过氧化的体外研究
作者：田浩明 梁荩忠 张翔迅
单位：610041成都市，华西医科大学附属第一医院
关键词：
中华医学杂志930521 近年来的研究发现，低密度脂蛋白(LDL)过氧化后其生物物理特性发生明显变化，并与动脉粥样硬化的发生有密度关系〔1〕。本试验对LDL在体外氧化后电泳迁移率，LDL中丙二醛(MDA)含量，以及对血小板聚集的影响进行了观察。
一、材料与方法
1.LDL的分离：正常人空腹12～14小时抽取静脉血，用EDTA抗凝，分离血浆，用溴化钾调整血浆密度，快速一次性密度超速离心分离LDL〔2〕，在含有EDTA生理盐水中透析去除溴化钾，过滤灭菌保存。
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2.LDL体外氧化：取LDL(1.7mg/ml)，于生理盐水中透析4小时，去除EDTA，置于含10nmol/L Cu2+的生理盐水中透析24小时(37℃)，分别于透析前及后3、5、10、14、18、24小时测MDA含量，及电泳迁移率。LDL在0.5%琼脂糖中进行〔3〕，油红O染色。
3.维生素C和维生素E对LDL过氧化的抑制：取LDL(方法同上)，分别置于含维生素E(80μm/L)、维生素C(40μm/L)、EDTA(0.01%)的10nmol/L Cu2+-生理盐水中，以及无抗氧化剂的Cu2+-生理盐水中透析12及24小时，测定MDA和电泳迁移率。
4.LDL过氧化后对正常人血小板聚集功能的影响：分别用未氧化的LDL、过氧化LDL及抗氧化剂抑制氧化的LDL(1.7mg/ml)各1.5ml，分别加入正常人富含血小板血浆4.5ml中，(25℃)放置30分钟，然后测定5分钟血小板聚集率(45.5μmol/L肾上腺素为聚集剂)。
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二、结果
1.LDL在氧化前其MDA含量为1.2nmol/ml，氧化后MDA含量逐渐升高，在18小时达高峰，为10.0nmol/ml。其电泳迁移率在氧化的前5小时无明显加快(0.75cm/2h)，以后逐渐加快，在24小时后达2.4cm/2h。LDL中MDA含量与电泳迁移率呈正相关(r=0.9099,n=7,Y=3.465X-1.42,P<0.05)。
2.当LDL在含有Cu2+的生理盐水中加入抗氧化剂维生素C、E或CDTA时，LDL中MDA含量无明显增加，电泳迁移率也无加快。
3.与氧化24小时的LDL一起孵育的血小板对肾上腺素诱导的聚集反应明显升高，5分钟时达100%。而与未氧化的LDL和用维生素C、E抑制氧化的LDL一起孵育的血小板对肾上腺素诱导的聚集反应基本相同，5分钟时分别为33±4%，40±7%。
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三、讨论
LDL经过氧化后与动脉粥样硬化的发生有密切关系。已知在某些病理情况下体内LDL过氧化现象增加〔4〕。在体外，LDL在Cu2+的参与下，通过自由基形成使LDL中不饱和脂肪酸发生氧化，形成过氧化脂质，最终形成MDA。由于LDL氧化后其中MDA含量增高，MDA可与LDL中载脂蛋白B的赖氨酸残基结合，使LDL带有更多的负电荷，故在电场中迁移速度加快，这种变化与LDL中MDA含量呈正比。过氧化的LDL使血小板敏感性增加。Cathcart等〔5〕发现氧化LDL能损害血小板膜导致血小板聚集的增加，并释放TXA2。此外，氧化LDL还能使血管内皮损伤，脱落，抑制血管内皮合成前列腺环素，抑制抗凝血因子Ⅲ的生物活性等作用，加速了动脉粥样硬化的形成。
已有许多研究发现维生素E、C对LDL氧化的抑制作用〔6〕，本实验也证实了这一作用。正常人因体内存在许多抗氧化物质和抗氧化酶。当某些病理情况下，体内抗氧化物质的减少，或自由基水平增高，LDL可发生氧化。因此，对这些病人补充一定量的抗氧化剂，对于防止动脉粥样硬化的发生是有益的。
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参考文献
1 Morel DW, Dicorleto PE,Chisolm GM.Endothelial and smooth muscle cells alter low density lipoprotein in vitrol by free radical oxidation.Arteriosclerosis 1984, 4:375.
2 Chung BH, Wilkinson T,Geer JC,et al. Preparative and quantitative isolation of plasma lipoprotein:rapid ,single discontinuous density gradient ultracentrifugation in a vertical rotor. J Lipid Res 1980,21:284.
3 Noble RP. Electrophoretic separation of plasma lipoproteins in agarose gels.J Lipid Res 1968, 9:693.
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4 罗照田，梁荩忠，张翔迅.糖尿病血清过氧化脂测定的意义.中华内科杂志1986，25：344.
5 Cathcaet MK,Morel DW,Chisolm GM.Monocytes and neutrophils oxidize low density lipoprotein making it cytotoxic.J Leukocyte Biol 1985,38:341.
6 Jialal I,Vega GL,Grundy SM.Physiologic levels of ascorbate inhibit the oxidative modification of low density lipoprotein.Atherosclerosis 1990,82:185.
(收稿：1992-06-24 修回：1993-03-01), http://www.100md.com
单位：610041成都市，华西医科大学附属第一医院
关键词：
中华医学杂志930521 近年来的研究发现，低密度脂蛋白(LDL)过氧化后其生物物理特性发生明显变化，并与动脉粥样硬化的发生有密度关系〔1〕。本试验对LDL在体外氧化后电泳迁移率，LDL中丙二醛(MDA)含量，以及对血小板聚集的影响进行了观察。
一、材料与方法
1.LDL的分离：正常人空腹12～14小时抽取静脉血，用EDTA抗凝，分离血浆，用溴化钾调整血浆密度，快速一次性密度超速离心分离LDL〔2〕，在含有EDTA生理盐水中透析去除溴化钾，过滤灭菌保存。
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2.LDL体外氧化：取LDL(1.7mg/ml)，于生理盐水中透析4小时，去除EDTA，置于含10nmol/L Cu2+的生理盐水中透析24小时(37℃)，分别于透析前及后3、5、10、14、18、24小时测MDA含量，及电泳迁移率。LDL在0.5%琼脂糖中进行〔3〕，油红O染色。
3.维生素C和维生素E对LDL过氧化的抑制：取LDL(方法同上)，分别置于含维生素E(80μm/L)、维生素C(40μm/L)、EDTA(0.01%)的10nmol/L Cu2+-生理盐水中，以及无抗氧化剂的Cu2+-生理盐水中透析12及24小时，测定MDA和电泳迁移率。
4.LDL过氧化后对正常人血小板聚集功能的影响：分别用未氧化的LDL、过氧化LDL及抗氧化剂抑制氧化的LDL(1.7mg/ml)各1.5ml，分别加入正常人富含血小板血浆4.5ml中，(25℃)放置30分钟，然后测定5分钟血小板聚集率(45.5μmol/L肾上腺素为聚集剂)。
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二、结果
1.LDL在氧化前其MDA含量为1.2nmol/ml，氧化后MDA含量逐渐升高，在18小时达高峰，为10.0nmol/ml。其电泳迁移率在氧化的前5小时无明显加快(0.75cm/2h)，以后逐渐加快，在24小时后达2.4cm/2h。LDL中MDA含量与电泳迁移率呈正相关(r=0.9099,n=7,Y=3.465X-1.42,P<0.05)。
2.当LDL在含有Cu2+的生理盐水中加入抗氧化剂维生素C、E或CDTA时，LDL中MDA含量无明显增加，电泳迁移率也无加快。
3.与氧化24小时的LDL一起孵育的血小板对肾上腺素诱导的聚集反应明显升高，5分钟时达100%。而与未氧化的LDL和用维生素C、E抑制氧化的LDL一起孵育的血小板对肾上腺素诱导的聚集反应基本相同，5分钟时分别为33±4%，40±7%。
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三、讨论
LDL经过氧化后与动脉粥样硬化的发生有密切关系。已知在某些病理情况下体内LDL过氧化现象增加〔4〕。在体外，LDL在Cu2+的参与下，通过自由基形成使LDL中不饱和脂肪酸发生氧化，形成过氧化脂质，最终形成MDA。由于LDL氧化后其中MDA含量增高，MDA可与LDL中载脂蛋白B的赖氨酸残基结合，使LDL带有更多的负电荷，故在电场中迁移速度加快，这种变化与LDL中MDA含量呈正比。过氧化的LDL使血小板敏感性增加。Cathcart等〔5〕发现氧化LDL能损害血小板膜导致血小板聚集的增加，并释放TXA2。此外，氧化LDL还能使血管内皮损伤，脱落，抑制血管内皮合成前列腺环素，抑制抗凝血因子Ⅲ的生物活性等作用，加速了动脉粥样硬化的形成。
已有许多研究发现维生素E、C对LDL氧化的抑制作用〔6〕，本实验也证实了这一作用。正常人因体内存在许多抗氧化物质和抗氧化酶。当某些病理情况下，体内抗氧化物质的减少，或自由基水平增高，LDL可发生氧化。因此，对这些病人补充一定量的抗氧化剂，对于防止动脉粥样硬化的发生是有益的。
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参考文献
1 Morel DW, Dicorleto PE,Chisolm GM.Endothelial and smooth muscle cells alter low density lipoprotein in vitrol by free radical oxidation.Arteriosclerosis 1984, 4:375.
2 Chung BH, Wilkinson T,Geer JC,et al. Preparative and quantitative isolation of plasma lipoprotein:rapid ,single discontinuous density gradient ultracentrifugation in a vertical rotor. J Lipid Res 1980,21:284.
3 Noble RP. Electrophoretic separation of plasma lipoproteins in agarose gels.J Lipid Res 1968, 9:693.
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4 罗照田，梁荩忠，张翔迅.糖尿病血清过氧化脂测定的意义.中华内科杂志1986，25：344.
5 Cathcaet MK,Morel DW,Chisolm GM.Monocytes and neutrophils oxidize low density lipoprotein making it cytotoxic.J Leukocyte Biol 1985,38:341.
6 Jialal I,Vega GL,Grundy SM.Physiologic levels of ascorbate inhibit the oxidative modification of low density lipoprotein.Atherosclerosis 1990,82:185.
(收稿：1992-06-24 修回：1993-03-01), http://www.100md.com