丙型肝炎病毒基因5’—末端非编码区酶切分型研究
作者：杜绍财 陶其敏 朱 凌 刘金祥 王 豪 孙 炎
单位：100034北京医科大学第二临床学院肝病研究所(杜绍财、陶其敏、朱 凌、刘金祥)，肝炎病房(王 豪、孙 炎)
关键词：丙型肝炎；基因型；RNA，病毒；聚合酶链反应
中华医学杂志930106 摘要 对来自不同地区的219例丙型肝炎患者行丙型肝火病毒(HCV)基因5＇—末端非编码区酶切分型。分型结果表明，HCVⅡ型感染为83%，Ⅲ型型感染为14%，Ⅱ/Ⅲ型混合感染为2%。提示中国HCV感染是以Ⅱ型为主，其次是Ⅲ型和Ⅱ/Ⅲ型混合感染。不同地区亚型分布构成无显著差异。
近两年来，丙型肝炎病毒(HCV)分子生物学研究进展十分迅速，国内外[1～3]报道了HCV克隆的核苷酸序列有很大差异，美国以Ⅰ型为主，日本以Ⅱ型为主，从序列分析结果证实日本株与中国株具有一定的同源性。中国以Ⅱ型为主，其次是Ⅲ型，未检出Ⅰ型和Ⅳ型[4]。NS5及5＇—末端非编码区酶切分型研究，PT—1(Ⅰ)、K1(Ⅱ)、K2a(Ⅲ)、K2b(Ⅳ)具有不同的酶切点[5]。本研究是在上述基础上，根据中国HCV感染的情况，设计的一项简便的分型方法，现将分型结果报道如下。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
1.试剂：(1)HCV RNA PCR试剂盒为16人份/kit，由本研究所制备，批号920426；Taq_p为SABC产品；逆转录酶为Promega公司产品。(2)限制性内切酶：HaeⅢ 16μ/ml，SABC产品。(3)Ⅱ、Ⅲ型对照血清：经日本自治医科大学检测确定。
2.血清标本：北京地区血清(包括输血后血清)标本，由本所提供；武汉地区血清，由武汉同济医院儿科提供；广州地区血清，由广州铁路中心医院传染科提供；西安地区血清，由第四军大学西京医院提供；重庆地区(重症肝炎)血清，由重庆医科大学附属第二医院提供；广西地区(肝癌)血清为国家“七五”功关课题收集的标本，-30℃保存，由广西医学院流行病教研组提供。
二、方法
1.HCV RNA检测：HCV RNA PCR按试剂盒操作方法进行。HCV RNA阳性样品，再进行基因分型研究。
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2.HCV基因分型方法：按文献[6]方法进行。
结 果
不同基因型HCV RNA的5＇—末端非编码区序列具有高度的遗传保守性，由于基因的变异，该区的个别硷基排列不同，而产生限制性内切酶的切点也发生变化，酶切后可得到不同的cDNA片段，根据有无特异的酶切点及片段的长度，判断HCV基因型(附图)。
1Ⅱ/Ⅲ混合型；2，6，8为Ⅲ型；3～5，7，9，10为Ⅱ型
附图 HCV基因型
一、不同地区HCV基因分型结果(表1)
由表1可见北京与武汉地区HCV基因分型构成比x2检验无显著差异。
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二、输血后与散发性丙型肝炎基因分型结果(表2)
64例输血后肝炎中，51例有输血史，11例曾输入血浆制品，1例曾输入血小板。1例曾输入白蛋白；33例散发性丙型肝炎中，均无输血史及血制品史。两组基因分型构成比x2检验无显著性差异。
讨 论
有关HCV基因分型研究，1990年Enomoto等[7]应用酶切分型技术证实日本存在两种亚型。1991年Nakao等[5]对50例丙型肝炎的基因分型结果：PT—1(Ⅰ)为2%、K1(Ⅱ)为74%、K2a(Ⅲ)为16%、K2b(Ⅳ)为8%。1992年王宇等[4]应用分型PCR技术检测45例中国人HCV基因分型，结果Ⅱ型占73%、Ⅲ型占18%，并证实存在Ⅱ/Ⅲ型混合感染，未检出Ⅰ和Ⅳ型。
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表1 不同地区HCV基因分型结果 地区
检测例数
HCV基因型
Ⅱ(%)
Ⅲ(%)
Ⅱ/Ⅲ(%)
北京
113
90(80)
22(19)
1(1)
武汉
40
, http://www.100md.com
35(88)
4(10)
1(2)
广州
23
20(87)
1(4)
2(9)
西安
13
11(85)
2(15)
0
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重庆
16
13(80)
2(13)
1(6)
广西
14
14(100)
0
0
合计
219
183(83)
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31(14)
5(2)
表2 输血后与散发性丙型肝炎基因分型 诊断
检测例数
HCV基因型
Ⅱ(%)
Ⅲ(%)
Ⅱ/Ⅲ(%)
输血后丙型肝炎
64
51(79)
13(20)
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1(1)
散发性丙型肝炎
33
25(76)
8(24)
0
合 计
97
76(78)
21(21)
1(1)
本研究应用经分型PCR证实的HCVⅡ、Ⅲ型血清PT-PCR产物，再用Hae Ⅲ内发酶消化，证实Ⅱ型无Hae Ⅲ酶切点，Ⅲ型具有Hae Ⅲ酶切点。从HCV不同类型序列分的资料证实，HCVⅠ型也无Hae Ⅲ切点，Ⅳ型有Hae Ⅲ酶切点。
, 百拇医药
本研究结果进一步证实了中国HCV感染是以Ⅱ型为主，北京、武汉、广州、西安等地区。HCV Ⅱ型感染率分别为80%，Ⅲ型为13%，Ⅱ/Ⅲ型为6%；14例肝细胞癌患者，HCV RNA、抗-HCV及HBsAg均阳性，为HBV及HCV双重感染。肝脏损伤的程度及肝癌是否与HCV亚型或HCV Ⅱ型感染有关有待进一步研究。
本组64例输血后丙型肝炎及33例散发性丙型肝炎的血清标HCV基因分型结果，输血后肝炎组，Ⅱ型感染为79%、Ⅲ型为30%、Ⅱ/Ⅲ型1%，而散发性丙型肝炎组Ⅱ型为76%，Ⅲ型为24%，未检出混合型，提示Ⅱ/Ⅲ型混合感染可能与输血制品有关。
本研究承蒙重庆医科大学附属二院张定风教授、武汉同济医院儿科方峰、广州铁路中心医院传染科邱望尤同志、西安第四军医大学西京医院陈伟红同志及广西医学院流行病教研室等大力支持，特此致谢 参考文献
1 Kato N.Hijikata M,Ootsuyama Y,et al.Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A,non-B hepatitis.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:9524.
, http://www.100md.com
2 Okamoto H,et al.Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated froma human carrier comparision with reported isolates for conserved and divergent regions.J Gen Viral,1991,72:2697.
3 王 宇，陶其敏。中国人丙型肝炎病毒结构基因cDNA分子克隆及序列分析。病毒学报1992；(印刷中)。
4 Wang Y,Okamoto H,Mishiro S.Hepatitis C virus genotypes in China,Lancet,1992.339:1168.
5 Nakao T,Enomoto N,Takada N,et al,Typing of hepatitis C virus genomes by restriction fragment length polymerpgism.J Gen Viral,1991,72(Pt9):2105.
6 杜绍财，陶其敏，丙型肝炎及肝癌病人HCV基因分型研究。北京医科大学学报，1992，24：353。
7 Enomoto N,Takada A,Nakao T,et al.There are two major types of hepatitis C virus in Japan,Biochem Biophys Res Commun,1990,170:1021.
(收稿：1992-10-19), http://www.100md.com
单位：100034北京医科大学第二临床学院肝病研究所(杜绍财、陶其敏、朱 凌、刘金祥)，肝炎病房(王 豪、孙 炎)
关键词：丙型肝炎；基因型；RNA，病毒；聚合酶链反应
中华医学杂志930106 摘要 对来自不同地区的219例丙型肝炎患者行丙型肝火病毒(HCV)基因5＇—末端非编码区酶切分型。分型结果表明，HCVⅡ型感染为83%，Ⅲ型型感染为14%，Ⅱ/Ⅲ型混合感染为2%。提示中国HCV感染是以Ⅱ型为主，其次是Ⅲ型和Ⅱ/Ⅲ型混合感染。不同地区亚型分布构成无显著差异。
近两年来，丙型肝炎病毒(HCV)分子生物学研究进展十分迅速，国内外[1～3]报道了HCV克隆的核苷酸序列有很大差异，美国以Ⅰ型为主，日本以Ⅱ型为主，从序列分析结果证实日本株与中国株具有一定的同源性。中国以Ⅱ型为主，其次是Ⅲ型，未检出Ⅰ型和Ⅳ型[4]。NS5及5＇—末端非编码区酶切分型研究，PT—1(Ⅰ)、K1(Ⅱ)、K2a(Ⅲ)、K2b(Ⅳ)具有不同的酶切点[5]。本研究是在上述基础上，根据中国HCV感染的情况，设计的一项简便的分型方法，现将分型结果报道如下。
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材料与方法
一、材料
1.试剂：(1)HCV RNA PCR试剂盒为16人份/kit，由本研究所制备，批号920426；Taq_p为SABC产品；逆转录酶为Promega公司产品。(2)限制性内切酶：HaeⅢ 16μ/ml，SABC产品。(3)Ⅱ、Ⅲ型对照血清：经日本自治医科大学检测确定。
2.血清标本：北京地区血清(包括输血后血清)标本，由本所提供；武汉地区血清，由武汉同济医院儿科提供；广州地区血清，由广州铁路中心医院传染科提供；西安地区血清，由第四军大学西京医院提供；重庆地区(重症肝炎)血清，由重庆医科大学附属第二医院提供；广西地区(肝癌)血清为国家“七五”功关课题收集的标本，-30℃保存，由广西医学院流行病教研组提供。
二、方法
1.HCV RNA检测：HCV RNA PCR按试剂盒操作方法进行。HCV RNA阳性样品，再进行基因分型研究。
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2.HCV基因分型方法：按文献[6]方法进行。
结 果
不同基因型HCV RNA的5＇—末端非编码区序列具有高度的遗传保守性，由于基因的变异，该区的个别硷基排列不同，而产生限制性内切酶的切点也发生变化，酶切后可得到不同的cDNA片段，根据有无特异的酶切点及片段的长度，判断HCV基因型(附图)。
1Ⅱ/Ⅲ混合型；2，6，8为Ⅲ型；3～5，7，9，10为Ⅱ型
附图 HCV基因型
一、不同地区HCV基因分型结果(表1)
由表1可见北京与武汉地区HCV基因分型构成比x2检验无显著差异。
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二、输血后与散发性丙型肝炎基因分型结果(表2)
64例输血后肝炎中，51例有输血史，11例曾输入血浆制品，1例曾输入血小板。1例曾输入白蛋白；33例散发性丙型肝炎中，均无输血史及血制品史。两组基因分型构成比x2检验无显著性差异。
讨 论
有关HCV基因分型研究，1990年Enomoto等[7]应用酶切分型技术证实日本存在两种亚型。1991年Nakao等[5]对50例丙型肝炎的基因分型结果：PT—1(Ⅰ)为2%、K1(Ⅱ)为74%、K2a(Ⅲ)为16%、K2b(Ⅳ)为8%。1992年王宇等[4]应用分型PCR技术检测45例中国人HCV基因分型，结果Ⅱ型占73%、Ⅲ型占18%，并证实存在Ⅱ/Ⅲ型混合感染，未检出Ⅰ和Ⅳ型。
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表1 不同地区HCV基因分型结果 地区
检测例数
HCV基因型
Ⅱ(%)
Ⅲ(%)
Ⅱ/Ⅲ(%)
北京
113
90(80)
22(19)
1(1)
武汉
40
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35(88)
4(10)
1(2)
广州
23
20(87)
1(4)
2(9)
西安
13
11(85)
2(15)
0
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重庆
16
13(80)
2(13)
1(6)
广西
14
14(100)
0
0
合计
219
183(83)
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31(14)
5(2)
表2 输血后与散发性丙型肝炎基因分型 诊断
检测例数
HCV基因型
Ⅱ(%)
Ⅲ(%)
Ⅱ/Ⅲ(%)
输血后丙型肝炎
64
51(79)
13(20)
, 百拇医药
1(1)
散发性丙型肝炎
33
25(76)
8(24)
0
合 计
97
76(78)
21(21)
1(1)
本研究应用经分型PCR证实的HCVⅡ、Ⅲ型血清PT-PCR产物，再用Hae Ⅲ内发酶消化，证实Ⅱ型无Hae Ⅲ酶切点，Ⅲ型具有Hae Ⅲ酶切点。从HCV不同类型序列分的资料证实，HCVⅠ型也无Hae Ⅲ切点，Ⅳ型有Hae Ⅲ酶切点。
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本研究结果进一步证实了中国HCV感染是以Ⅱ型为主，北京、武汉、广州、西安等地区。HCV Ⅱ型感染率分别为80%，Ⅲ型为13%，Ⅱ/Ⅲ型为6%；14例肝细胞癌患者，HCV RNA、抗-HCV及HBsAg均阳性，为HBV及HCV双重感染。肝脏损伤的程度及肝癌是否与HCV亚型或HCV Ⅱ型感染有关有待进一步研究。
本组64例输血后丙型肝炎及33例散发性丙型肝炎的血清标HCV基因分型结果，输血后肝炎组，Ⅱ型感染为79%、Ⅲ型为30%、Ⅱ/Ⅲ型1%，而散发性丙型肝炎组Ⅱ型为76%，Ⅲ型为24%，未检出混合型，提示Ⅱ/Ⅲ型混合感染可能与输血制品有关。
本研究承蒙重庆医科大学附属二院张定风教授、武汉同济医院儿科方峰、广州铁路中心医院传染科邱望尤同志、西安第四军医大学西京医院陈伟红同志及广西医学院流行病教研室等大力支持，特此致谢 参考文献
1 Kato N.Hijikata M,Ootsuyama Y,et al.Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A,non-B hepatitis.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:9524.
, http://www.100md.com
2 Okamoto H,et al.Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated froma human carrier comparision with reported isolates for conserved and divergent regions.J Gen Viral,1991,72:2697.
3 王 宇，陶其敏。中国人丙型肝炎病毒结构基因cDNA分子克隆及序列分析。病毒学报1992；(印刷中)。
4 Wang Y,Okamoto H,Mishiro S.Hepatitis C virus genotypes in China,Lancet,1992.339:1168.
5 Nakao T,Enomoto N,Takada N,et al,Typing of hepatitis C virus genomes by restriction fragment length polymerpgism.J Gen Viral,1991,72(Pt9):2105.
6 杜绍财，陶其敏，丙型肝炎及肝癌病人HCV基因分型研究。北京医科大学学报，1992，24：353。
7 Enomoto N,Takada A,Nakao T,et al.There are two major types of hepatitis C virus in Japan,Biochem Biophys Res Commun,1990,170:1021.
(收稿：1992-10-19), http://www.100md.com