美国立克次体学和立克次体病学会第九届年会简介
作者：俞树荣
单位：(第三军医大学微生物学教研室，630038)
关键词：
中华医学杂志920426
美国立克次体学和立克次体病学会第九届年会于1991年5月1～15日在美国得克萨斯州加尔维斯敦举行。参加会议的共约120余人，除美国外，有苏联、日本、法国、埃及、澳大利亚、以色列等国的学者参加。我国有7名克次体学工作者参加了这次年会。现将本次会议学术交流的主要内容简介如下。
一、埃立克体病
自1986年在美国阿肯色州以血清学证实第一例由犬埃立克体(Ehrlichia canis)引起的人埃立克体病以来，目前已证明美国有20个州存在埃立克体病，发现可能为犬埃立克体感染病例已达215例。美国疾病控制中心(CDC)、华特里德陆军研究所等单位的Dawson等人从1例21岁的病人血液中分离到1株埃立克体，电镜下观察到感染细胞内有被以宿主胞浆膜的包含体，血清学和16s rRNA顺序显示此分离株与犬埃立克体相似。分子生物学研究表明，埃立克体和恙虫病立克次体一样，细胞壁的外膜外叶均较厚，缺乏微荚膜和粘液层，不能证明有脂多糖(LPS)存在，也缺少17000蛋白抗原基因产物。青霉素可作用埃立克体形成球状体(Spheroplast)。用16s rRNA基因顺序作聚合酶链反应(PCR)能鉴别埃立克体属内新种，并可判定它们之间同源性的亲疏，将埃立克体分为3个分支：使人和犬致病的犬埃立克体(包括在粒细胞内寄生者)为一支，腺热埃立克体(E,sennetsu)和立氏埃立克体(E. risticii)为一支，马埃立克体(E. equi)为第三支。培养于P388D1细胞内的腺热埃立克体纯化后作SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和免疫印迹证明，该病原体含9种主要抗原蛋白，即112000、91000、72500、69000、61500、50000、26500、23500和21000，其中有些是与犬埃立克体呈交叉反应的抗原。
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二、斑疹伤寒
斑疹伤寒，特别是鼠型斑疹伤寒在美国和世界其他地区仍有发生。1980～1989年美国得克萨斯州报告鼠型斑疹伤寒405例，仅有30%病例有跳蚤叮咬史或家里有跳蚤，27%家中发现老鼠。已经证明，与蜱、螨感染立克次体能经卵传递一样，莫氏立克次体也可经蚤卵传递，下代蚤具有传染性，并且在感染蚤的中肠上皮细胞、肠腔和前胃均发现立克次体，能通过叮咬传播。
美国南阿拉巴马大学医学院分子生物学实验室在普氏立克次体的生理学方面做了大量工作，我国青年科学工作者参与了这些研究。他们的研究表明，由普氏立克次体分离纯化的RNA多聚酶与大肠杆菌者不同，不能用线形模板，仅仅环状负超螺旋质粒DNA才能作为体外转录的模板，可能是因为立克次体RNA多聚酶不能松开DNA双链。他们由立克次体ADP/ATP移位酶基因(tlc)的启动子样序列下游约220bp一个转录终止区与质粒构建成表达载体。转录分析显示，与大肠杆菌启动子有广泛同源性的立克次体序列，可以被立克次体RNA多聚酶利用在体外生成约240核苷酸的RNA转录物；启动子样序列5'末端上游的立克次体序列可增强特异性转录。目前他们正应用DNA序列分析和DNA酶I足迹技术研究立克次体启动子的特征。与对磺胺药敏感的细菌不同，普氏立克次体可以直接利用周围环境中的叶酸，能由宿主细胞浆运输二氢叶酸而不需自身合成，也许是立克次体对磺胺药不敏感的原因之一。但是，可能由于普氏立克次体对异常生长环境的适应，也有实验显示当甲氨喋呤存在时，即使宿主细胞本身已被抑制，普氏立克次体的生长仍然可以正常。关于普氏立克次体二氨基庚二酸合成，除了与一般细菌一样由天冬氨酸合成途径外，因普氏立克次体有一非常活跃的赖氨酸运输系统，也有可能通过一种新的酶由赖氨酸合成。
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在研究干扰素抑制普氏立克次体生长时发现，不同细胞系对干扰素的反应不一。在人RD114细胞中，γ干扰素抑制普氏立克次体的生长不明显；但在人GM2767A细胞中则相反，立克次体生长被显著抑制。α、β干扰素能抑制立克次体在鼠源细胞系Ltkaprt细胞内的生长。
此外，这个分子生物学实验室还分离许多普氏立克次体基因，如编码普氏立克次体RNA多聚酶主要sigma因子的基因、gyrA基因、pepA基因等，对进一步研究其产物的功能和立克次体的基因调控将起到重要作用。
三、斑点热
WHO立克次体参考的研究合作中心对许多国家的立克次体病调查发现，各国存在这类疾病并不少见。例如苏联黑海沿岸的“阿斯特拉罕热”经微量免疫荧光和免疫印迹诊断为斑点热，并以PCR和酶切片段分析证实其病原体为康氏立克次体。
斑点热群立克次体分子生物学研究，对鉴定本群立克次体种间差别有重要意义。Dasch等用斑点热和斑疹伤寒群立克次体17000共同蛋白抗原基因顺序434bp区域作PCR，其扩增物的许多酶切图谱相似；不同血清型立克次体的17000基因序列测定，一般也与立克次体基因组DNA的Southern杂交结果相吻合。因而报告者提出，17000序列测定可作为衡量立克次体变异程度的一种方法。落矶山实验室报道，立克次体190和120000表面抗原分别为单拷贝的RrompA和RsompB基因编码。另外，CDC等许多实验室用PCR/限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析，鉴定了欧美新近分离的斑点热群立克次体的基因型。Walker等对世界许多地区分离的康氏立克次体和以色列斑点热群立克次体，用单克隆抗体作免疫荧光和免疫印迹进行抗原分析，并将康氏立克次体基因与λgtrr构建重组体，证明其体含T细胞抗原决定簇，可能在康氏立克次体的细胞免疫应答中有重要意义。日本立克次体的SDS-PAGE显示三个大于100000的主要多肽(120000、135000和145000)，但标本经100℃5分钟后再作SDS-PAGE则呈现135000和185000两条带。用λgt 11 构建日本立克次体基因文库，经亚克隆后可在大肠杆菌中表达这些表面多肽的融合蛋白。
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关于致病性研究，我国留学生李晗等用流式细胞计分析康氏立克次体对靶细胞的粘附作用，结果表明，立克次体的粘附结构对胰蛋白酶和热敏感者，可能是立克次体的表面蛋白，宿主受体也对胰蛋白酶敏感。不耐热和胰蛋白酶敏感的115000表面蛋白单克隆抗体可部分阴断立克次体粘附。立氏克次体对康氏立克次体的粘附有竞争性抑制作用。
在实验室诊断上，用LPS-ELISA抗原作斑点热群IgG抗体检测比用全细胞溶解抗原作ELISA要特异得多。一种特定决定簇封闭ELISA(DEB-ELISA)具种特异性，可检定斑点热群感染中不同种立克次体抗体。法国马赛的一个立克次体实验室报道，将地中海斑点热病人循环内皮细胞经浓集后，用间接免疫荧光可在4小时内检出细胞内的康氏立克次体。
四、恙虫病
日本学者Tamura在会上作了“日本恙虫病立克次体的新发现”的专题报告。认为恙虫病立克次体的抗原变异与立克次体表面的54000～56000蛋白的抗原性有关，而且也与立克次体对小鼠的毒力相关联。目前，日本除了研究这些抗原型的地区分布及用基因克隆方法分析不同株抗原结构的差异外，许多寄生虫病学者正从事恙螨的季节分布及其孳生问题的研究。苍白纤恙螨的垂直传播恙虫病立克次体试验发现，只有立克次体阳性的雌虫才能垂直传播，而雄虫尽管其组织内(包括睾丸)有不少立克次体也不能传播；虽然在精原细胞浆内存在病原体，但在精子发生过程中立克次体在细胞内消失。泰国学者从老鼠体内分离出许多株立克次体，并用免疫荧光首次证明尖盾水鸟恙螨(Blankaartia acuscutellaris)有恙虫病立克次体感染。
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免疫学研究证明，CD4+T细胞在恙虫病宿主防御机制中起重要作用。免疫小鼠T协助细胞产生大量IL2和小量γIFN，提示该T细胞主要是I型T协助细胞(TH-I)。虽然恙虫病立克体在巨噬细胞中的生长能被γ干扰素抑制，但在鼠胚成纤维细胞中γ干扰素无抑制作用；而单独β干扰素或α、β干扰素联用，在成纤维细胞中则显示对立克次体生长的抑制。
五、Q热
与大肠杆菌相似，Q热立克次体具有编码三羧酸循环酶类的一组基因。但对这一组紧密相联基因的序列分析显示，大肠杆菌与Q热立克次体仍有所不同。前者琥珀酸脱氢酶基因(sdhB)末端与α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)起始密码子相距302bp，而后者为23bp。Q热立克次体枸橼酸合成酶基因(gltA)与琥珀酸脱氢酶基因间的距离为3.3kb，而在大肠杆菌则为707bp。
Q热立克次体的超氧化物歧化酶基因已经克隆、序列测定并在大肠杆菌中表达成功。这对研究立克次体在细胞内的存活机制及其与超氧化物歧化酶作用的关系提供了有利条件。美国陆军传染病医学研究所报道，一种Q热立克次体的插入顺序，用PCR及Southern杂交分析不仅可能检出Q热立克次体存在，或许还对立克次体株的鉴别有所帮助。到目前为止，立克次体中仍然只发现Q热立克次体有质粒，而急性质粒QpHI含-6Kb DNA区域(GED)为慢性质粒QpRS所缺如。GED亚克隆后至少可编码7种5500～42300多肽。一种1022bp长编码42300蛋白的开读架(CbhE')，乃急性Q热分离株独特的质粒基因；它的-35区域为TCAACT，-10区域TAAAAT，SD序列为AGAAGGA。QpRS质粒基因称CbbE'，编码55000表面抗原，其序列为TTTAAT-(N)15-TATAAT。
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Q热的临床表现除因病原体不同(含不同质粒)而有异外，也有宿主的免疫状态有关。急性质粒型和慢性质粒型立克次体株均严重抑制近交鼠系A/J和C57BL/6鼠细胞免疫应答，前列腺素E2水平增高。有的报告指出，Q热立克次体的免疫调节作用与宿主脾脏和胸腺效应淋巴样细胞群的质和量变化有关。由细胞免疫的检测指标显示，主要T细胞刺激抗原为富含蛋白的立克次体三氯醋酸提取细胞残余物，而I相LPS虽为主要保护性抗原，但它基本上无刺激或抑制活性，可能在B细胞或巨噬细胞水平上发挥作用。为了研究慢性Q热的发病机理等问题，实验性Q热性心内膜炎动物模型已经建立成功。
Raoult等发现急性Q热的早期诊断用免疫印迹法测IgG比微量间接荧光抗体法敏感得多。PCR已用于感染标本的快速诊断。1989年美国缅因州发生一起因感染猫分娩引起的Q热暴发，提示应重视预防与猫接触有关的Q热。特别是家庭型暴发病例的发生。有关Q热传播的研究发现，在感染雄性小鼠的精子头部有Q热立克次体吸附，而且受精雌鼠也证明有Q热感染，因此Q热的性传播问题应予注意。至于抗生素的应用，体外试验表明急性质粒型分离株与慢性分离株对抗生素敏感性不同，前者对四环素更为敏感，与临床治疗结果相一致。
六、战壕热
美国落矶山实验室研究战壕热病原体——五日热罗沙利马体Fuller株的染色体外基因时，没有发现超 螺旋附加DNA存在。CDC用16s rRNA序列分析和PCR/RFLP证实由一艾滋病病人分离出一株罗沙利马体样病原体。序列分析表明，其与五日热罗沙利马体和万氏罗沙利马体(Rochalimaea vinsonii)有>98%相关。由此可见，立克次体也可能在免疫损害的个体中引起机会感染。, http://www.100md.com
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中华医学杂志920426
美国立克次体学和立克次体病学会第九届年会于1991年5月1～15日在美国得克萨斯州加尔维斯敦举行。参加会议的共约120余人，除美国外，有苏联、日本、法国、埃及、澳大利亚、以色列等国的学者参加。我国有7名克次体学工作者参加了这次年会。现将本次会议学术交流的主要内容简介如下。
一、埃立克体病
自1986年在美国阿肯色州以血清学证实第一例由犬埃立克体(Ehrlichia canis)引起的人埃立克体病以来，目前已证明美国有20个州存在埃立克体病，发现可能为犬埃立克体感染病例已达215例。美国疾病控制中心(CDC)、华特里德陆军研究所等单位的Dawson等人从1例21岁的病人血液中分离到1株埃立克体，电镜下观察到感染细胞内有被以宿主胞浆膜的包含体，血清学和16s rRNA顺序显示此分离株与犬埃立克体相似。分子生物学研究表明，埃立克体和恙虫病立克次体一样，细胞壁的外膜外叶均较厚，缺乏微荚膜和粘液层，不能证明有脂多糖(LPS)存在，也缺少17000蛋白抗原基因产物。青霉素可作用埃立克体形成球状体(Spheroplast)。用16s rRNA基因顺序作聚合酶链反应(PCR)能鉴别埃立克体属内新种，并可判定它们之间同源性的亲疏，将埃立克体分为3个分支：使人和犬致病的犬埃立克体(包括在粒细胞内寄生者)为一支，腺热埃立克体(E,sennetsu)和立氏埃立克体(E. risticii)为一支，马埃立克体(E. equi)为第三支。培养于P388D1细胞内的腺热埃立克体纯化后作SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和免疫印迹证明，该病原体含9种主要抗原蛋白，即112000、91000、72500、69000、61500、50000、26500、23500和21000，其中有些是与犬埃立克体呈交叉反应的抗原。
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二、斑疹伤寒
斑疹伤寒，特别是鼠型斑疹伤寒在美国和世界其他地区仍有发生。1980～1989年美国得克萨斯州报告鼠型斑疹伤寒405例，仅有30%病例有跳蚤叮咬史或家里有跳蚤，27%家中发现老鼠。已经证明，与蜱、螨感染立克次体能经卵传递一样，莫氏立克次体也可经蚤卵传递，下代蚤具有传染性，并且在感染蚤的中肠上皮细胞、肠腔和前胃均发现立克次体，能通过叮咬传播。
美国南阿拉巴马大学医学院分子生物学实验室在普氏立克次体的生理学方面做了大量工作，我国青年科学工作者参与了这些研究。他们的研究表明，由普氏立克次体分离纯化的RNA多聚酶与大肠杆菌者不同，不能用线形模板，仅仅环状负超螺旋质粒DNA才能作为体外转录的模板，可能是因为立克次体RNA多聚酶不能松开DNA双链。他们由立克次体ADP/ATP移位酶基因(tlc)的启动子样序列下游约220bp一个转录终止区与质粒构建成表达载体。转录分析显示，与大肠杆菌启动子有广泛同源性的立克次体序列，可以被立克次体RNA多聚酶利用在体外生成约240核苷酸的RNA转录物；启动子样序列5'末端上游的立克次体序列可增强特异性转录。目前他们正应用DNA序列分析和DNA酶I足迹技术研究立克次体启动子的特征。与对磺胺药敏感的细菌不同，普氏立克次体可以直接利用周围环境中的叶酸，能由宿主细胞浆运输二氢叶酸而不需自身合成，也许是立克次体对磺胺药不敏感的原因之一。但是，可能由于普氏立克次体对异常生长环境的适应，也有实验显示当甲氨喋呤存在时，即使宿主细胞本身已被抑制，普氏立克次体的生长仍然可以正常。关于普氏立克次体二氨基庚二酸合成，除了与一般细菌一样由天冬氨酸合成途径外，因普氏立克次体有一非常活跃的赖氨酸运输系统，也有可能通过一种新的酶由赖氨酸合成。
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在研究干扰素抑制普氏立克次体生长时发现，不同细胞系对干扰素的反应不一。在人RD114细胞中，γ干扰素抑制普氏立克次体的生长不明显；但在人GM2767A细胞中则相反，立克次体生长被显著抑制。α、β干扰素能抑制立克次体在鼠源细胞系Ltkaprt细胞内的生长。
此外，这个分子生物学实验室还分离许多普氏立克次体基因，如编码普氏立克次体RNA多聚酶主要sigma因子的基因、gyrA基因、pepA基因等，对进一步研究其产物的功能和立克次体的基因调控将起到重要作用。
三、斑点热
WHO立克次体参考的研究合作中心对许多国家的立克次体病调查发现，各国存在这类疾病并不少见。例如苏联黑海沿岸的“阿斯特拉罕热”经微量免疫荧光和免疫印迹诊断为斑点热，并以PCR和酶切片段分析证实其病原体为康氏立克次体。
斑点热群立克次体分子生物学研究，对鉴定本群立克次体种间差别有重要意义。Dasch等用斑点热和斑疹伤寒群立克次体17000共同蛋白抗原基因顺序434bp区域作PCR，其扩增物的许多酶切图谱相似；不同血清型立克次体的17000基因序列测定，一般也与立克次体基因组DNA的Southern杂交结果相吻合。因而报告者提出，17000序列测定可作为衡量立克次体变异程度的一种方法。落矶山实验室报道，立克次体190和120000表面抗原分别为单拷贝的RrompA和RsompB基因编码。另外，CDC等许多实验室用PCR/限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析，鉴定了欧美新近分离的斑点热群立克次体的基因型。Walker等对世界许多地区分离的康氏立克次体和以色列斑点热群立克次体，用单克隆抗体作免疫荧光和免疫印迹进行抗原分析，并将康氏立克次体基因与λgtrr构建重组体，证明其体含T细胞抗原决定簇，可能在康氏立克次体的细胞免疫应答中有重要意义。日本立克次体的SDS-PAGE显示三个大于100000的主要多肽(120000、135000和145000)，但标本经100℃5分钟后再作SDS-PAGE则呈现135000和185000两条带。用λgt 11 构建日本立克次体基因文库，经亚克隆后可在大肠杆菌中表达这些表面多肽的融合蛋白。
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关于致病性研究，我国留学生李晗等用流式细胞计分析康氏立克次体对靶细胞的粘附作用，结果表明，立克次体的粘附结构对胰蛋白酶和热敏感者，可能是立克次体的表面蛋白，宿主受体也对胰蛋白酶敏感。不耐热和胰蛋白酶敏感的115000表面蛋白单克隆抗体可部分阴断立克次体粘附。立氏克次体对康氏立克次体的粘附有竞争性抑制作用。
在实验室诊断上，用LPS-ELISA抗原作斑点热群IgG抗体检测比用全细胞溶解抗原作ELISA要特异得多。一种特定决定簇封闭ELISA(DEB-ELISA)具种特异性，可检定斑点热群感染中不同种立克次体抗体。法国马赛的一个立克次体实验室报道，将地中海斑点热病人循环内皮细胞经浓集后，用间接免疫荧光可在4小时内检出细胞内的康氏立克次体。
四、恙虫病
日本学者Tamura在会上作了“日本恙虫病立克次体的新发现”的专题报告。认为恙虫病立克次体的抗原变异与立克次体表面的54000～56000蛋白的抗原性有关，而且也与立克次体对小鼠的毒力相关联。目前，日本除了研究这些抗原型的地区分布及用基因克隆方法分析不同株抗原结构的差异外，许多寄生虫病学者正从事恙螨的季节分布及其孳生问题的研究。苍白纤恙螨的垂直传播恙虫病立克次体试验发现，只有立克次体阳性的雌虫才能垂直传播，而雄虫尽管其组织内(包括睾丸)有不少立克次体也不能传播；虽然在精原细胞浆内存在病原体，但在精子发生过程中立克次体在细胞内消失。泰国学者从老鼠体内分离出许多株立克次体，并用免疫荧光首次证明尖盾水鸟恙螨(Blankaartia acuscutellaris)有恙虫病立克次体感染。
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免疫学研究证明，CD4+T细胞在恙虫病宿主防御机制中起重要作用。免疫小鼠T协助细胞产生大量IL2和小量γIFN，提示该T细胞主要是I型T协助细胞(TH-I)。虽然恙虫病立克体在巨噬细胞中的生长能被γ干扰素抑制，但在鼠胚成纤维细胞中γ干扰素无抑制作用；而单独β干扰素或α、β干扰素联用，在成纤维细胞中则显示对立克次体生长的抑制。
五、Q热
与大肠杆菌相似，Q热立克次体具有编码三羧酸循环酶类的一组基因。但对这一组紧密相联基因的序列分析显示，大肠杆菌与Q热立克次体仍有所不同。前者琥珀酸脱氢酶基因(sdhB)末端与α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)起始密码子相距302bp，而后者为23bp。Q热立克次体枸橼酸合成酶基因(gltA)与琥珀酸脱氢酶基因间的距离为3.3kb，而在大肠杆菌则为707bp。
Q热立克次体的超氧化物歧化酶基因已经克隆、序列测定并在大肠杆菌中表达成功。这对研究立克次体在细胞内的存活机制及其与超氧化物歧化酶作用的关系提供了有利条件。美国陆军传染病医学研究所报道，一种Q热立克次体的插入顺序，用PCR及Southern杂交分析不仅可能检出Q热立克次体存在，或许还对立克次体株的鉴别有所帮助。到目前为止，立克次体中仍然只发现Q热立克次体有质粒，而急性质粒QpHI含-6Kb DNA区域(GED)为慢性质粒QpRS所缺如。GED亚克隆后至少可编码7种5500～42300多肽。一种1022bp长编码42300蛋白的开读架(CbhE')，乃急性Q热分离株独特的质粒基因；它的-35区域为TCAACT，-10区域TAAAAT，SD序列为AGAAGGA。QpRS质粒基因称CbbE'，编码55000表面抗原，其序列为TTTAAT-(N)15-TATAAT。
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Q热的临床表现除因病原体不同(含不同质粒)而有异外，也有宿主的免疫状态有关。急性质粒型和慢性质粒型立克次体株均严重抑制近交鼠系A/J和C57BL/6鼠细胞免疫应答，前列腺素E2水平增高。有的报告指出，Q热立克次体的免疫调节作用与宿主脾脏和胸腺效应淋巴样细胞群的质和量变化有关。由细胞免疫的检测指标显示，主要T细胞刺激抗原为富含蛋白的立克次体三氯醋酸提取细胞残余物，而I相LPS虽为主要保护性抗原，但它基本上无刺激或抑制活性，可能在B细胞或巨噬细胞水平上发挥作用。为了研究慢性Q热的发病机理等问题，实验性Q热性心内膜炎动物模型已经建立成功。
Raoult等发现急性Q热的早期诊断用免疫印迹法测IgG比微量间接荧光抗体法敏感得多。PCR已用于感染标本的快速诊断。1989年美国缅因州发生一起因感染猫分娩引起的Q热暴发，提示应重视预防与猫接触有关的Q热。特别是家庭型暴发病例的发生。有关Q热传播的研究发现，在感染雄性小鼠的精子头部有Q热立克次体吸附，而且受精雌鼠也证明有Q热感染，因此Q热的性传播问题应予注意。至于抗生素的应用，体外试验表明急性质粒型分离株与慢性分离株对抗生素敏感性不同，前者对四环素更为敏感，与临床治疗结果相一致。
六、战壕热
美国落矶山实验室研究战壕热病原体——五日热罗沙利马体Fuller株的染色体外基因时，没有发现超 螺旋附加DNA存在。CDC用16s rRNA序列分析和PCR/RFLP证实由一艾滋病病人分离出一株罗沙利马体样病原体。序列分析表明，其与五日热罗沙利马体和万氏罗沙利马体(Rochalimaea vinsonii)有>98%相关。由此可见，立克次体也可能在免疫损害的个体中引起机会感染。, http://www.100md.com