肾综合征出血热患者血小板内游离钙离子浓度的变化
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赵千子,刘正稳,韩群英,高麦仓
肾综合征出血热;血小板;细胞内游离钙离子
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参见附件(290KB，3页)。
摘要：目的 探讨肾综合征出血热(HFRS) 患者血小板内游离钙离子浓度(\[Ca2+\]i)与疾病的相关性。方法 用流式细胞仪检测细胞中Fluo3的荧光强度，对42例确诊的HFRS患者血小板内\[Ca2+\]i进行测定，并以30例正常人作为对照。结果 检测显示，多尿期HFRS患者的\[Ca2+\]i显著高于正常对照组(P<0.01)，而发热期、少尿期及恢复期的\[Ca2+\]i与对照组之间无统计学差异(P>0.05)。结论 HFRS发病过程中有多种因素可以活化血小板，多尿期患者的血小板处于活化状态，而发热期和少尿期患者的血小板可能由于各种原因的功能缺陷导致其\[Ca2+\]i并不升高。
关键词：肾综合征出血热；血小板；细胞内游离钙离子
Study on the platelet intracellular free calcium concentration of patients with hemorrhagic fever with renal syndrome
Zhao Qianzi, Liu Zhengwen, Han Qunying, Gao Maicang
(Department of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the relationship between hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and intracellular free calcium concentration (\[Ca2+\]i) of platelets. Methods Fluorescence of Fluo3 was measured in platelets of 42 patients with HFRS and 30 healthy individuals as controls by flow cytometry. Results Platelet \[Ca2+\]i of patients with HFRS at the polyuric phase was significantly higher than that of the control group(P<0.01), while platelet \[Ca2+\]i of patients at the fever, oliguric and convalescence phases showed no significant difference from that of the control group(P>0.05). Conclusion Platelets from patients at the polyuric phase are highly activated, possibly in response to many factors in the progress of the disease. There is no significant difference between platelet \[Ca2+\]i of patients at the fever and oliguric phase and that of the control group, which is as widely accepted, possibly due to the functional deficiency of platelets during this disease.
KEY WORDS: HFRS; platelets; intracellular free calcium
肾综合征出血热( hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS) 是各种病毒性出血热中分布最广、发病数量最多、危害最大的一种急性传染病\[1\]。临床以发热、出血、肾脏功能损害为主要特征。出血见于HFRS整个病程，其程度轻重不一。引起HFRS患者出血的原因复杂多样，血小板减少及功能障碍是公认的原因之一。钙离子对血小板发挥正常生理功能起重要作用，阐明HFRS患者血小板功能状态及其\[Ca2+\]i变化的机制对HFRS发病机理的深入理解和新的有针对性的治疗方法的设计具有重要意义。因此，我们对HFRS患者血小板\[Ca2+\]i进行了检测并分析其与疾病的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料 病例为2004年12月至2005年6月本院及西安市第八医院住院患者42例，有典型的HFRS临床症状和体征，均经HFRS特异性IgM 抗体检测阳性而确诊。其中男32例，女10例，年龄18-65岁，平均(44.0±12.8)岁。临床分型危重型15例，重型12例，中型8例，轻型7例。对照组为正常健康人30例，其中男25例，女5例，年龄19-50岁，平均(33.8±7.6)岁。Fluo3 AM (美国Biotium公司) 用二甲亚砜配成0.5mmol/L，置-20℃冰箱保存。
1.2 方法 空腹采肘静脉血1mL，用EDTA抗凝，以800r/min的速度离心10min，取富血小板血浆200μL装入试管，加入Fluo3使其终浓度为4μmol/L。37℃孵育30min后用PBS稀释50倍，然后用流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)检测10000个血小板的荧光强度。在1mmol/L CaCl2存在的情况下加入Triton X100测定最大荧光值Fmax，加入20mmol/L EGTA测定最小荧光值Fmin。细胞内钙离子浓度计算公式为：\[ Ca2 +\]i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)nmol/L(Kd为Fluo3与Ca2 +反应的解离常数，Kd=450nmol/L)\[23\]。
1.3 数据统计分析 实验结果以均数±标准差表示，以t检验和方差分析进行统计学处理，P<0.05表明差异有统计学意义。用SPSS12.0统计分析系统完成处理过程。
2 结果
检测结果显示，HFRS患者多尿期血小板\[Ca2+\]i与正常对照组之间有显著性差异(P<0.01)，而发热期、少尿期和恢复期血小板\[Ca2+\]i与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。HFRS各期血小板\[Ca2+\]i之间没有显著性差异(P>0.05)。HFRS患者多尿期和正常对照组血小板\[Ca2+\]i的Fluo3荧光强度流式细胞仪检测结果见图1、图2。HFRS患者发热期、少尿期、多尿期和恢复期血小板\[Ca2+\]i检测结果及其与正常对照组的比较见表1 。
图1 正常对照组的血小板内Fluo3荧光强度流式细胞仪检测结果(略)
Fig.1 Fluorescence of Fluo3 in platelets of control by flow cytometry
图2 HFRS患者的血小板内Fluo3荧光强度流式细胞仪检测结果(略)
Fig.2 Fluorescence of Fluo3 in platelets of patient with HFRS by flow cytometry
表1 HFRS患者和正常对照组的血小板内游离钙离子浓度(略)
Table 1 Results of platelet \[Ca2+\]i in HFRS patients and controls
3 讨论
HFRS是一组由汉坦病毒( hantavirus, HV) 引起的以发热、出血和肾脏损害为主症的急性传染病。出血为HFRS 最常见的临床特征之一，轻者仅表现为皮肤、黏膜小的出血点，重者则可见腔道、皮肤广泛出血，甚至颅内出血,有时成为患者致死的重要原因。引起HFRS患者出血的原因有很多，血小板减少及功能障碍是其中重要的原因之一。
血小板是一种多功能细胞。它在凝血、止血、维持血管内皮完整等多种生理及病理过程中发挥重要作用。血小板内\[Ca2+\]i的升高是血小板受外界不良刺激后受累范围的第二信使。在血小板形状发生变化、粘连、聚集时首先出现血小板内钙离子的升高\[4\]。在HFRS的发病过程中，有多种原因可能导致其升高。首先，现已发现血小板表面的糖蛋白β3整合素介导了致病性汉坦病毒对细胞的感染，而由β3整合素介导的信号转导系统可以引起细胞内钙离子的升高\[56\]。第二，机体对病毒感染产生的特异性抗体可直接作用于黏附在血小板表面的抗原，而非特异性抗体则黏附于被病原体损伤的血小板表面。此外，有研究在患者血小板表面发现特异性免疫复合物，这种免疫复合物可能激活血小板\[78\]。第三，HFRS患者血浆中的血小板活化因子含量自发热期开始升高，低血压期达高峰\[9\]。有人认为，这种因子一旦与血小板表面的特异性受体结合，便可引起血小板胞浆内的钙离子浓度变化。第四，HFRS发病过程中，血栓素(TXA)2水平升高，而前列环素(PGI)2水平下降，造成PGI2/TXA 2比值严重失衡\[10\]。PGI2是一种很强的内源性血小板聚集抑制剂，而TXA 2 具有促进血小板聚集的作用。第五，肾上腺素是一种低分子血小板活化诱导剂。研究发现，患者在发热、低血压休克及少尿期血浆肾上腺素水平高于正常\[1112\]。
我们发现，多尿期HFRS患者血小板的\[Ca2+\]i显著高于正常对照组。说明多尿期HFRS患者的血小板处于明显活化状态，可能是上述多种原因及其他未知的原因引起。
本次实验中未发现发热期和少尿期HFRS患者的\[Ca2+\]i与对照组之间有统计学差异，可能与样本例数较少有关，也有可能与以往认为HFRS中血小板黏附、聚集功能缺陷有关。HFRS发病过程中，汉坦病毒可侵入患者骨髓巨核细胞，造成血小板超微结构异常\[13\]。此外，生长停滞特异性基因产物6(Gas6)通过其受体激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和丝/苏氨酸激酶(Akt)，并刺激β3整合素胞浆内段酪氨酸残基的磷酸化从而放大了血小板聚集时的外向内信号传导，在血小板的第二相聚集过程中起关键作用\[14\]。而汉坦病毒与β3整合素的作用可能影响到此信号传导过程。
恢复期HFRS患者的\[Ca2+\]i与对照组之间没有统计学差异，可能是因为疾病进入恢复期后，血小板功能及机体各方面功能逐步恢复正常状态。
HFRS患者血小板活化及其\[Ca2+\]i升高的具体机制的阐明对HFRS发病机理的深入理解和新的有针对性的治疗方法的设计具有重要意义。
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(编辑 韩维栋)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30271176)；陕西省科技攻关资助项目(2004K17G8)
通讯作者：刘正稳. Email: zhengwenl@sohu.com
作者简介：赵千子(1981)，女(汉族)，硕士在读.
(西安交通大学医学院第一附属医院传染科，陕西西安 710061)
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