关节内注射川芎嗪对兔膝关节软骨退变的影响
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王锁良 ,王 民 ,吴施慧
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参见附件(423KB，4页)。
摘要：目的 观察川芎嗪关节腔内注射对骨关节炎过程中软骨退变的保护作用，探讨川芎嗪关节腔注射治疗骨关节炎的应用前景。方法 健康成熟新西兰大白兔26只，设立正常组、模型组、对照组和实验组。模型组、对照组及实验组建立骨关节炎模型。对照组与实验组分别关节腔注射地塞米松0.3mL和川芎嗪0.3mL。每周一次。在模型建立6周和9周时各组分别处死一半动物，去除关节炎模型，取材进行大体标本病理学观察，并经光镜和透射电镜观察膝关节软骨的病理变化。结果 在6和9周时，实验组的大体标本软骨损伤分级明显优于其他3组；Mankin软骨组织学评分与上述两组相比，有非常显著性差异(P<0.01)；电镜超微结构观察其病理改变明显轻于对照组和模型组。对照组大体标本软骨损伤分级与模型组基本相同；Mankin 软骨组织学评分与模型组比较无显著性差异(P>0.05)；电镜超微结构观察对照组与模型组在细胞形态、细胞内细胞器改变等方面相似。结论 关节腔内注射川芎嗪能减轻兔膝关节炎模型的关节软骨退变程度，并可促进软骨的自身修复；激素关节腔内注射对损伤软骨的修复作用不明显。
关键词：骨关节炎；川芎嗪；关节腔注药
The effect of intraarticular ligustrazine injection on degenerative cartilage of the rabbits knee
Wang Suoliang, Wang Min, Wu Shihui
(Department of Rehabilitation and Pain; Department of Orthopeadics; Department of GeriatricSurgery, First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To observe the effects of ligustrazine intraarticular injection on cartilage degeneration in OA. To estimate and discuss the vistas of clinical application with ligustrazine intraarticular injection. Methods 26 New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups, 2 rabbits in normal group, 8 rabbits in model, control and experimental group, respectively. OA animal model was established in rabbits by the way of fixing right posterior knee joint with plaster cast in strecthing state in model, control and experimental group. 0.3mL ligustrazine intraarticular injection was carried out once a week in experimental group. 0.3mL dexamethasone in the same way was made in control group. At 6 week and 9 weeks later, optic and electron microscopic examinations were conducted to observe the pathological changes of articular cartilage of the knee of these animals. Results There was a significant difference in Mankin scale between experimental group and 3 other groups(P<0.01). The articular cartilage changes of ultrastructure with the transmission electron microscope observation was better than 3 other groups. There was no significant difference in Mankin scale between control group and model group(P>0.05), and between these 2 groups the electro microscopic observation was similar. Conclusion Intraarticular injection of ligustrazine can alleviate degeneration and promote selfreparation of articular cartilage. Method of intraarticular injection of cortisocteroid has no reparation effect on OA cartilage degeneration.
KEY WORDS: osteoarthritis; ligustrazine; intraarticular injection
骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是一种严重影响患者生活质量和工作的常见病、多发病，系关节软骨的退变和继发性骨质增生所致的一种慢性骨关节病。膝关节OA发病率最高。由于其病因病理尚不完全清楚，因此，OA治疗成为临床治疗的难题之一。近年来，陆续有采用中药关节腔注射治疗膝骨关节炎的报道，而许多基础研究也表明川芎嗪有很好的防治关节软骨退变的作用，有望成为治疗骨关节炎的有效方法之一。
1 材料与方法
1.1 材料 实验动物：健康成熟新西兰大白兔26只，体质量2.5-3.0kg，雌雄不限，由西安交通大学实验动物中心提供。实验仪器：日本日立H600透射式电子显微镜，LKBV型超薄切片机，奥林巴斯光学显微镜。
1.2 方法 26只动物随机分为4组，正常组2只动物(观察双侧后肢正常关节软骨)，其余3组为模型组、实验组及对照组，每组各8只动物。采用膝关节制动建立模型的方法\[1\]建立骨关节炎模型。将3组动物右膝关节用长腿管型石膏固定于完全伸直位，关节制动。正常组动物不予任何处理，正常喂养，观察软骨正常形态。模型组仅行关节固定，不作其他处理，评价造模方法，并与实验组、对照组比较。实验组和对照组所固定的膝关节前部石膏开窗作为关节腔注药部位。骨关节炎模型建立后，实验组关节腔注射川芎嗪0.3mL，每周一次；对照组关节腔注射地塞米松0.3mL，每周一次。在6周时，分别取各组半数动物，采用空气栓塞法处死，打开关节腔进行大体标本观察，去股骨内、外髁全层软骨进行光镜和透射电镜观察。9周时，分别处死各组剩余的半数动物，以同样的方法进行处理观察。
大体标本观察：按软骨损伤分级法将软骨退变程度分为：0级正常；Ⅰ级关节软骨变为黄白色，光泽差，表面仍较平滑；Ⅱ级在Ⅰ级的基础上出现溃疡改变，溃疡未及全层；Ⅲ级软骨全层破坏，软骨下骨暴露。
将取出的股骨髁软骨标本行常规固定，脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色，在光学显微镜(OM)下观察。依据改良Mankin法中的结构、细胞以及潮线的完整性进行OA评分。
电镜(EM)观察：软骨组织样品取出后，固定48h，脱钙2周，乙醇梯度脱水，乙醇醋酸双氧铀块染2h或过夜；环氧树脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片(1-2μm)，美兰染色后光学显微镜下定位，超薄切片(50-70nm)，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射式电子显微镜下进行超微结构观察并拍照。
1.3 统计学处理 实验数据以均数±标准差(±s)表示，两组间比较用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 大体标本观察 4组动物膝关节腔均无感染。各组软骨组织损伤分级见表1。
表1 各组软骨组织损伤分级(略)
Table 1 The grades of cartilage tissue injury in each group
2.2 普通光学显微镜观察 正常组：软骨表面光滑，软骨细胞排列规则，层次清楚，潮线完整；基质染色均匀(图1a)。模型组：软骨表面裂隙明显，局部有缺损，软骨细胞排列紊乱，软骨细胞减少，并见灶性溶解、坏死；潮线多数消失，血管自软骨下骨长入软骨钙化层。软骨厚度变薄，基质异染性增强(图1b)。实验组：软骨表面局部有滑膜被覆，纤维组织轻度增生，软骨细胞增生、肥大，排列稍紊乱，潮线模糊，有毛细血管增生，基质异染性不明显(图1c)。对照组：软骨表面粗糙不平，有裂隙，局部有缺损，软骨细胞排列紊乱，软骨厚度变薄，潮线多数消失，基质有异染性(图1d)。各组动物软骨组织Mankin评分见表2。
表2 各组动物软骨组织Mankin评分(略)
Table 2 The Mankin grades of cartilage tissue in each group
2.3 透射电镜观察 正常组： 软骨细胞基本正常，细胞核略圆核内染色质分布均匀；细胞内可见到大量的粗面内质网，线粒体细长，游离核糖体、高尔基体及糖原颗粒可见到；细胞表面有一些短小的绒毛样突起伸向细胞周围的陷窝，其周围的基质中含有许多纤细的胶原纤维(图2a)。模型组：大部分软骨细胞明显肿胀，细胞表面的突起减少；细胞核形状不规则，核内染色质边集，电子密度增加；细胞质内多数细胞器溶解、消失，仅存的少量线粒体明显肿胀，内质网扩张成池样；细胞周围的胶原纤维减少，排列紊乱(图2b)。实验组：软骨细胞大部分正常，细胞呈椭圆形或梭形，细胞核内异染色质轻度边集，细胞内粗面内质网丰富，池内充满细颗粒样物质，线粒体轻度肿胀；细胞表面有较多的突起，细胞周围胶原纤维排列规则(图2c)。对照组：大部分软骨细胞呈退化改变，梭形细胞较少，细胞肿胀，表面有少量的突起；细胞核形状不规则，核内染色质边集，电子密度增加；线粒体明显肿胀，内质网扩张成池样(图2d)。
图1 各组膝关节软骨的病理变化情况(略)
Fig.1 The pathological changes of articular cartilage of the knee in each group (HE×100)
Normal group(a): The surface of the cartilage is smooth, the cartilage cell arranges regularly; there is no hyperplasty or hypertrophy of cartilage cells. The dyeing of matrix is even
Model group(b): Shallow fissures and local defections on the surface of the cartilage, the part cartilage cells dissolution. The tide line inordinate and partly disappears. Some pannus material forms
Experimental group(c): Synovium on surface, cartilage cells hypertrophied and tide line illegible; matrix metachromatic is not clear
Control group(d): The surface is rough, fissures and local defections can be found, the thickness of cartilage reduces, the tide line is inordinate, and the matrix is metachromitic
图2 各组膝关节软骨的电镜观察(略)
Fig.2 The EM observation of articular cartilage of the knee in each group (×5000)
Normal group(a): Normal cells and nucleus, the inner chromatin distribute even, mitochondrions, Golgi complex, glycogenosome, collagen fibers can be found. Villose on the surface of the cell
Model group(b): The cell tumid,the superficial prominences reduce or disappear, few cytoplasmic organelles and collagen fibers, the coarse endoplasmic reticulas extend to poolshape, containing low electron density materials
Experimental group(c): The cells are generally normal, heterochromatin bordergathered, coarse endoplasmic reticulas and collagen fibers are plenty, the mitochondrion is slightly tumid, prominences are on the surface
Control group(d): Cells degenerate and become tumid. There are few cytoplasmic organelles and perficial prominences
3 讨论
器官、组织的损伤或功能丧失是人类最常见的、最具危害性的同时也是花费最高的疾病，骨关节炎就是其中之一。据报道50% 65岁及其以上的老人，至少丧失5项运动能力\[2\]。目前针对不同患者、不同关节位置和不同病理阶段有许多治疗方法，但各种方法都有其局限性，成功率极低，不能从根本上治愈关节炎。而OA 治疗中广泛应用的非甾体抗炎药物虽可减轻疼痛，但具有很强的不良反应；激素类药物关节腔注射有很好的缓解症状、改善功能的作用，但不能促进损伤软骨的恢复。肖晓山等\[3\]实验研究结果提示，关节内注射皮质类固醇对关节软骨的损害是肯定的，且随给药次数的增加而加重，因此关节内注射皮质类固醇宜慎用。近年来治疗膝关节炎的中医药研究有了较大发展，中药关节腔注射疗法是研究的主要方向之一，研究筛选关节腔注射治疗骨关节炎的中药药物，有其重大的现实意义。
骨关节炎实验动物模型的建立是研究OA病理的必要手段。当动物的下肢关节机械制动一段时间后，局部不论是否施以外加压力，关节软骨均可出现与临床相似的退行性改变。研究发现，将兔膝关节于伸直位制动5-6周，即可得到OA动物模型\[4\]。本实验通过管型长腿石膏伸直位固定家兔右后肢，在6周、9周时，光镜及电镜均观察到家兔关节软骨明显的退行性改变，模型组Mankin软骨组织评分与正常组比较，差异非常显著(P<0.01)，从而进一步证实了关节制动造模方法的可行性。
随着对骨性关节炎发病机制认识的逐步深入，骨性关节炎治疗已经有了很大的进展，祖国医学也在治疗骨关节炎方面积累了丰富的经验。目前，许多中药治疗骨关节炎的研究已深入到微循环、骨内压、自由基、细胞因子等分子水平。研究显示某些中药在改善微循环，清除自由基等关节软骨的损伤因子方面有很好的效果。
川芎嗪是中药川芎的有效成分，是首选活血化淤中药\[5\]。川芎嗪防治OA的药理作用可归纳为以下几个方面：①抑制血小板聚集及抗凝作用；②扩张血管，改善微循环，降低骨内压；③抑制软骨和滑膜的炎症，促进软骨细胞增殖和蛋白合成；④免疫功能及细胞因子的调节作用；⑤抗自由基作用。
王文瑞等\[6\]作兔膝关节炎模型采用川芎嗪注射液关节腔注射观察其对关节软骨的保护作用。实验结果发现川芎嗪能提高软骨组织超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低软骨组织丙二醛(MDA)及关节液糖胺多糖(GAG)浓度，可更有效的清除氧自由基，起到抑制软骨退变的作用；同时认为川芎嗪延缓软骨退变的机制可能还与川芎嗪抑制血小板凝集、降低血液黏度、改善血液流变学有关。吕红斌等\[7\]用同位素示踪的方法观察4种中药对软骨细胞DNA、蛋白多糖、胶原合成的影响，并用扫描电镜及透视电镜从超微结构上观察4种中药对软骨细胞的影响。结果发现当归和川芎嗪有显著促进体外培养的兔软骨细胞DNA的合成及促进软骨细胞蛋白多糖和胶原合成的作用，从而促进软骨损伤的修复。晏雪生等\[8\]采用家兔关节软骨细胞体外培养模型，加入不同程度川芎嗪注射液，观察软骨细胞增殖和总蛋白合成情况。结果发现川芎嗪有效成分可促进软骨细胞分泌合成代谢因子，刺激软骨细胞增殖和蛋白质合成。
本实验结果表明，在6周及9周时，对照组大体标本软骨损伤分级与模型组的基本相同，Mankin 软骨组织学评分与模型组比较无显著性差异(P>0.05)，电镜超微结构观察对照组与模型组在细胞形态、细胞内细胞器改变等方面相似。这与文献报道相符合，证明了激素类药物关节腔内注射不能促进损伤软骨的恢复。在临床上，激素类药物关节腔注射却能缓解疼痛，改善症状，这与其局部的消炎作用有关，而从损伤软骨改善的角度看不宜滥用，故建议激素类药物仅用于急性炎症期，以改善症状。实验组的大体标本软骨损伤分级明显优于模型组和对照组；Mankin软骨组织学评分与上述两组相比有非常显著的差异(P<0.01)，电镜超微结构观察到软骨细胞大部分正常，细胞内粗面内质网丰富，细胞周围胶原纤维丰富，排列规则等，其病理改变明显轻于对照组和模型组。这与其他相关的研究报道相吻合，证明川芎嗪有抑制基质降解、促进损伤软骨恢复的作用。总之，采用膝关节制动方法可获得满意的骨关节炎动物模型。关节腔内注射川芎嗪能减轻兔膝关节炎模型的关节软骨退变程度，并可促进软骨的自身修复。激素关节腔内注射对损伤软骨的修复作用不明显。
参考文献：
\[1\]汪青春，沈培芝，王海彬. 骨关节炎动物模型的建立及选择 \[J\]. 中医正骨,1998,10(3):3940.
\[2\]陈延文，段岩平，张静波. 关节软骨与关节炎 \[J\]. 解剖科学进展, 1996,2(2):103109.
\[3\]肖晓山，肖林添，刘煜. 膝关节腔内注射皮质类固醇对关节软骨损害的研究病理组织学和超微结构观察 \[J\]. 临床麻醉学杂志, 1997,13(5):264266.
\[4\]江捍平，王大平. 骨关节炎动物模型 \[J\]. 中国现代医学杂志, 2004,14(6):153156.
\[5\]郭春燕，李振良综述. 川芎嗪的药理作用与临床应用研究进展 \[J\]. 医学综述, 2001,7(7):436437.
\[6\]王文瑞，刘宏泽，卫小春,等.川芎嗪防治膝关节软骨退变的实验研究 \[J\]. 中国骨伤, 2004,17(2):8082.
\[7\]吕红斌，岳珍，王嘉芙. 四种中药对体外培养的软骨细胞代谢的影响 \[J\]. 中国运动医学杂志,1995,14(2):135137.
\[8\]晏雪生，彭亚琴，明安萍. 川芎嗪注射液对体外培养软骨影响的实验研究 \[J\]. 中国中医骨伤科杂志, 2002,10(1):1517.
(编辑 卓选鹏)
作者简介：王锁良(1962)，男(汉族)，硕士，副主任医师，主要从事疼痛疾病的诊治研究. Email: wslycyn@163.com
(西安交通大学医学院第一附属医院：康复中心疼痛科；骨科；老年外科，陕西西安 710061)
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