双灵固本散对人胃癌细胞凋亡相关基因表达的调节
【摘要】 目的 观察双灵固本散对人胃癌细胞凋亡相关基因表达的调节。方法 用人细胞凋亡基因芯片对双灵固本散处理前后人胃癌细胞BGC-823凋亡相关基因的表达水平变化进行定量研究。结果 在检测到有明显表达差别的15个凋亡相关基因中，14个基因的mRNA丰度在药物处理后明显升高，一个基因的mRNA丰度在药物处理后明显降低。结论 在本实验中，证明双灵固本散具有诱导体外胃癌细胞的凋亡作用，并可能是通过外部(extrinsic)凋亡途径实现的。
【关键词】 灵芝(Ganoderma lucidum Karst )；双灵固本散；细胞凋亡；胃癌
The regulation of sunrecome(shuanglinggubensan)on the expression of apoptosis related genes in human gastric tumor cell
TANG Li,LI Zhi-hong,WANG Tao,et al.
School of Life Sciences of Shanghai University, Shanghai 200436,China
【Abstract】 Objective Methods In this research work, the change of the expression of the apoptosis related genes in cultured gastric tumor cell BGC-823 after treatment with a commercial traditional Chinese medicine product -Sunrecome(Shuanglinggubensan) was measured, by using apoptosis related gene array (purchased from Superarray).Results The drug treatment up-regulated the expression of 14 apoptosis related genes markedly, while the expression of 1 apoptosis related gene was down-regulated.Conclusion The Sunrecome(Shuanglinggubensan) turned on the programmed cell death of the cultured gastric tumor cell via the extrinsic apoptosis pathway instead of the mitochondria related pathway.
【Key words】 ganoderma lucidum karst;sunrecome(shuanglinggubensan);apoptosis;gastric tumor
灵芝(Ganoderma lucidum Karst)是一种传统的中药，属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属。灵芝首载于《神农本草经》，历代医家都认为其能治疗多种疾病。
现代药理研究表明，灵芝具有多方面的生物活性和药理作用。主要表现为，灵芝多糖对免疫反应的增强作用[1，2]，灵芝中三萜成分的抗癌作用等，已证明灵芝有诱导人乳腺癌细胞[3]、胸腺癌细胞[4]、前列腺癌细胞[5]、结肠癌细胞[6]等凋亡的作用。同时，灵芝多糖对糖尿病[7]、肝损伤的修复[8]、心血管系统疾病[9～11]也都有很好的疗效。
迄今为止，大多数的研究只停留在对灵芝及其有效成分的生理作用的研究，及对某些代谢途径的少数几种酶活性或其基因表达水平作用的研究上。笔者在电镜观察到双灵固本散诱导癌细胞凋亡的基础上，采用基因芯片法，对双灵固本散处理后的人胃癌细胞BGC-823进行细胞凋亡研究，以期为双灵固本散良好的疗效提供更全面的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
双灵固本散由上海绿谷(集团)公司生物医药研究所提供；人胃腺瘤细胞BGC-823购于中科院细胞所；人细胞凋亡基因芯片(GEArray Q Series Human Apoptosis Gene Array)购于美国Superarray公司。
CO2培养箱，Thermo Forma公司；倒置显微镜，Nikon公司； Gene Quant核酸定量仪, Pharmacia Biocech 公司；Heraeus高速冷冻离心机， Biofuge公司；Mill-Q超纯水净化仪，Millipore公司； 1640完全培养液，Bibgo公司；Trizol试剂，上海生工(生物工程技术)有限公司提供，其余药品均为进口试剂。所有实验用品均经灭菌处理。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将对数生长的胃癌细胞BGC-823置于37℃，100%相对湿度，含5%二氧化碳、95%空气的培养箱内，在含15%小牛血清的RPMI 1640培养液中贴壁生长，以EDTA-胰酶混合溶液消化传代。
1.2.2 细胞的药物处理 以20ml(1.0×105/ml)剂量浓度接种在50ml培养瓶中，孵育24h后，倾去培养液，将加药培养液(5mg/ml)加入3个生长BGC-823的培养瓶中，每瓶20ml，对照组每瓶加20ml不加药物的1640培养液，孵育24h后，倾去培养液，每瓶加5ml胰酶溶液消化，待细胞脱壁后，将消化液转移至15ml离心管中，50g离心5min，倒出上清液，细胞沉淀于离心管中液氮冷冻，然后转移到-70℃保存。
1.2.3 细胞总RNA的提取 将药物处理过的细胞样品和对照细胞样品(每管约1×107个细胞)分别用1ml的Trizol试剂重悬，用匀浆器将细胞匀浆，然后按生工提供的方法提取总RNA，将70%乙醇洗过的RNA溶解于DEPC处理过的水中，并用GeneQuant定量。
1.2.4 cDNA探针的标记 按Superarray公司提供的方法标记对照和处理样品的cDNA。总RNA的用量为15～20μg。
1.2.5 芯片的杂交及检测 按Superarray Human Apoptosis Q series试剂盒(HS-002-2/HS-002N-2)及其化学发光检测试剂盒的方法进行，稍有改动。
1.2.6 芯片检测结果的分析 用ScanAlyser和GEArray Analyzer软件分析杂交的结果。每个基因的表达量用每个杂交点的信号强度除以看家基因GAPD的强度表示。基因的表达水平变化=药物处理细胞中基因表达水平/未经药物处理细胞中基因表达水平。变化超过3倍即认为变化显著。
2 结果与讨论
如图1所示，笔者用从Superarray公司购买的GEArray Q系列人细胞凋亡芯片，对双灵固本散处理和未经药物处理的胃癌细胞BGC-823中与细胞凋亡有关的96个基因的表达水平进行了杂交检测。将杂交结果定量后发现15个杂交信号明显(表达量>1.0E-1)的基因中，5个参与p53和ATM途径的基因chk1, GADD45, Hus1, mdm2, rpa， 4个Caspase家族基因caspase-1(ICE), caspase-14, caspase-3(ccp32), caspase-5, 2个CARD家族的基因bcl-10/HuE10, Cardiac/Rip2, 1个IAP家族的基因Apollon/Bruce，1个TNF受体家族基因LTbR，1个TRAF家族基因TANK(I-TRAF)的表达水平明显升高(大于2倍)，而属于CARD家族的Apaf-1的表达水平明显降低，见表1。
Fig.1 A.The hybridization of the biotin-labeled cDNA from the drug treated gastric tumor cell BGC-823 to the GEArray Q seris Human Apoptosis Gene Array (Catalog No. HS-002N purchased from Superarray).(略)
B.The hybridization of the biotin-labeled cDNA from non-drug-treated BGC-823 to the same array as in A.(略)
Table 1 The quantitation of the Fig 1 hybridization (human apoptosis)by ScanAlyze and GEArray Analyzer(略)
细胞凋亡是细胞形态的变化，而该变化是由一系列的蛋白水解酶的级联激活引起的。处于上游的水解酶称为激活水解酶(activator)，它们水解激活下游的效应水解酶(称为effector)。激活后的效应水解酶进一步水解细胞中的蛋白激酶以及其他信号传递蛋白，细胞骨架及核基质蛋白，染色质修饰及DNA修复蛋白，以及核酸酶的抑制亚基。Caspase-3处于水解酶级联激活链的最下端，是细胞凋亡的内部途径和外部途径的交汇点。
本实验中Caspase-3以及其他Caspase升高，可能是为了提供凋亡所需大量蛋白酶活性需要的结果。而其他的一些表达升高的蛋白是起到在上游传递外部凋亡信号以及激活蛋白水解酶的作用的。参与线粒体凋亡途径的Apaf-1表达水平的显著降低，以及未发现线粒体凋亡途径相关基因表达的升高，再加上外部凋亡途径TNF受体家族及一些外部凋亡途径调节蛋白基因表达的升高，都说明很可能是通过外部途径(extrinsic pathway)而不是线粒体途径引起细胞的凋亡，并且可能直接或间接抑制了内部凋亡途径(线粒体途径)。还需要在蛋白以及酶活性的水平来进一步证明这一观点。
【参考文献】
1 Gao Y, Zhou S, Jiang W,et al. Effects of ganopoly (a Ganoderma lucidum polysaccharide extract) on the immune functions in advanced-stage cancer patients. Immunol Invest,2003,32(3):201-215.
2 Hsu MJ, Lee SS, Lee ST,et al. Signaling mechanisms of enhanced neutrophil phagocytosis and chemotaxis by the polysaccharide purified from Ganoderma lucidum. Br J Pharmacol,2003,139(2):289-298.
3 Hu H, Ahn NS, Yang X,et al. Ganoderma lucidum extract induces cell cycle arrest and apoptosis in MCF-7 human breast cancer cell. Int J Cancer，2002,102(3):250-253.
4 Lakshmi B, Ajith TA, Sheena N,et al. Antiperoxidative, anti-inflammatory, and antimutagenic activities of ethanol extract of the mycelium of Ganoderma lucidum occurring in South India. Teratog Carcinog Mutagen，2003，1:85-97.
5 Sliva D, Sedlak M, Slivova V,et al.Biologic activity of spores and dried powder from Ganoderma lucidum for the inhibition of highly invasive human Breast and prostate cancer cells. J Altern Complement Med，2003，9(4):491-497.
6 Kimura Y, Taniguchi M, Baba K. Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: mechanism of action and isolation of an active substance. Anticancer Res，2002，22(6A):3309-3318.
7 Zhang HN, He JH, Yuan L,et al. In vitro and in vivo protective effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on alloxan-induced pancreatic islets damage. Life Sci,2003,83(18):2307-2319.
8 Ng PC, Kong YC, Ko KM,et al.Antioxidant activity of Ganoderma Lucidum: protective effects on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity. Acta Horticulture (Netherlands)，1993，332:219-225.
9 Jin H, Zhang G, Cao X,et al. Treatment of hypertension by ling zhi combined with hypotensor and its effects on arterial, arteriolar and capillary pressure and microcirculation. In: Nimmi H, Xiu RJ, Sawada T, Zheng C. (eds). Microcirculatory Approach to Asian Traditional Medicine. New York: Elsevier Science,1996,131.
10 张红梅，田辉凯，姚小皓，等.绿谷灵芝对人脐静脉内皮细胞ICAM-1和VCAM-1表达的影响.中国药理学通报，2002，18(4)：460-464.
11张红梅，姚伟娟，田辉凯，等.绿谷灵芝抑制低密度脂蛋白的氧化及单核细胞对内皮细胞的粘附作用.中国中西医结合杂志，2002，22(7)：534-537.
(编辑：石 岚)
作者单位： 200436 上海，上海大学生命科学学院, 百拇医药(唐犁，李志宏，王涛，吴侯，王沂，郭江宁，翁新楚)
【关键词】 灵芝(Ganoderma lucidum Karst )；双灵固本散；细胞凋亡；胃癌
The regulation of sunrecome(shuanglinggubensan)on the expression of apoptosis related genes in human gastric tumor cell
TANG Li,LI Zhi-hong,WANG Tao,et al.
School of Life Sciences of Shanghai University, Shanghai 200436,China
【Abstract】 Objective Methods In this research work, the change of the expression of the apoptosis related genes in cultured gastric tumor cell BGC-823 after treatment with a commercial traditional Chinese medicine product -Sunrecome(Shuanglinggubensan) was measured, by using apoptosis related gene array (purchased from Superarray).Results The drug treatment up-regulated the expression of 14 apoptosis related genes markedly, while the expression of 1 apoptosis related gene was down-regulated.Conclusion The Sunrecome(Shuanglinggubensan) turned on the programmed cell death of the cultured gastric tumor cell via the extrinsic apoptosis pathway instead of the mitochondria related pathway.
【Key words】 ganoderma lucidum karst;sunrecome(shuanglinggubensan);apoptosis;gastric tumor
灵芝(Ganoderma lucidum Karst)是一种传统的中药，属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属。灵芝首载于《神农本草经》，历代医家都认为其能治疗多种疾病。
现代药理研究表明，灵芝具有多方面的生物活性和药理作用。主要表现为，灵芝多糖对免疫反应的增强作用[1，2]，灵芝中三萜成分的抗癌作用等，已证明灵芝有诱导人乳腺癌细胞[3]、胸腺癌细胞[4]、前列腺癌细胞[5]、结肠癌细胞[6]等凋亡的作用。同时，灵芝多糖对糖尿病[7]、肝损伤的修复[8]、心血管系统疾病[9～11]也都有很好的疗效。
迄今为止，大多数的研究只停留在对灵芝及其有效成分的生理作用的研究，及对某些代谢途径的少数几种酶活性或其基因表达水平作用的研究上。笔者在电镜观察到双灵固本散诱导癌细胞凋亡的基础上，采用基因芯片法，对双灵固本散处理后的人胃癌细胞BGC-823进行细胞凋亡研究，以期为双灵固本散良好的疗效提供更全面的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
双灵固本散由上海绿谷(集团)公司生物医药研究所提供；人胃腺瘤细胞BGC-823购于中科院细胞所；人细胞凋亡基因芯片(GEArray Q Series Human Apoptosis Gene Array)购于美国Superarray公司。
CO2培养箱，Thermo Forma公司；倒置显微镜，Nikon公司； Gene Quant核酸定量仪, Pharmacia Biocech 公司；Heraeus高速冷冻离心机， Biofuge公司；Mill-Q超纯水净化仪，Millipore公司； 1640完全培养液，Bibgo公司；Trizol试剂，上海生工(生物工程技术)有限公司提供，其余药品均为进口试剂。所有实验用品均经灭菌处理。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将对数生长的胃癌细胞BGC-823置于37℃，100%相对湿度，含5%二氧化碳、95%空气的培养箱内，在含15%小牛血清的RPMI 1640培养液中贴壁生长，以EDTA-胰酶混合溶液消化传代。
1.2.2 细胞的药物处理 以20ml(1.0×105/ml)剂量浓度接种在50ml培养瓶中，孵育24h后，倾去培养液，将加药培养液(5mg/ml)加入3个生长BGC-823的培养瓶中，每瓶20ml，对照组每瓶加20ml不加药物的1640培养液，孵育24h后，倾去培养液，每瓶加5ml胰酶溶液消化，待细胞脱壁后，将消化液转移至15ml离心管中，50g离心5min，倒出上清液，细胞沉淀于离心管中液氮冷冻，然后转移到-70℃保存。
1.2.3 细胞总RNA的提取 将药物处理过的细胞样品和对照细胞样品(每管约1×107个细胞)分别用1ml的Trizol试剂重悬，用匀浆器将细胞匀浆，然后按生工提供的方法提取总RNA，将70%乙醇洗过的RNA溶解于DEPC处理过的水中，并用GeneQuant定量。
1.2.4 cDNA探针的标记 按Superarray公司提供的方法标记对照和处理样品的cDNA。总RNA的用量为15～20μg。
1.2.5 芯片的杂交及检测 按Superarray Human Apoptosis Q series试剂盒(HS-002-2/HS-002N-2)及其化学发光检测试剂盒的方法进行，稍有改动。
1.2.6 芯片检测结果的分析 用ScanAlyser和GEArray Analyzer软件分析杂交的结果。每个基因的表达量用每个杂交点的信号强度除以看家基因GAPD的强度表示。基因的表达水平变化=药物处理细胞中基因表达水平/未经药物处理细胞中基因表达水平。变化超过3倍即认为变化显著。
2 结果与讨论
如图1所示，笔者用从Superarray公司购买的GEArray Q系列人细胞凋亡芯片，对双灵固本散处理和未经药物处理的胃癌细胞BGC-823中与细胞凋亡有关的96个基因的表达水平进行了杂交检测。将杂交结果定量后发现15个杂交信号明显(表达量>1.0E-1)的基因中，5个参与p53和ATM途径的基因chk1, GADD45, Hus1, mdm2, rpa， 4个Caspase家族基因caspase-1(ICE), caspase-14, caspase-3(ccp32), caspase-5, 2个CARD家族的基因bcl-10/HuE10, Cardiac/Rip2, 1个IAP家族的基因Apollon/Bruce，1个TNF受体家族基因LTbR，1个TRAF家族基因TANK(I-TRAF)的表达水平明显升高(大于2倍)，而属于CARD家族的Apaf-1的表达水平明显降低，见表1。
Fig.1 A.The hybridization of the biotin-labeled cDNA from the drug treated gastric tumor cell BGC-823 to the GEArray Q seris Human Apoptosis Gene Array (Catalog No. HS-002N purchased from Superarray).(略)
B.The hybridization of the biotin-labeled cDNA from non-drug-treated BGC-823 to the same array as in A.(略)
Table 1 The quantitation of the Fig 1 hybridization (human apoptosis)by ScanAlyze and GEArray Analyzer(略)
细胞凋亡是细胞形态的变化，而该变化是由一系列的蛋白水解酶的级联激活引起的。处于上游的水解酶称为激活水解酶(activator)，它们水解激活下游的效应水解酶(称为effector)。激活后的效应水解酶进一步水解细胞中的蛋白激酶以及其他信号传递蛋白，细胞骨架及核基质蛋白，染色质修饰及DNA修复蛋白，以及核酸酶的抑制亚基。Caspase-3处于水解酶级联激活链的最下端，是细胞凋亡的内部途径和外部途径的交汇点。
本实验中Caspase-3以及其他Caspase升高，可能是为了提供凋亡所需大量蛋白酶活性需要的结果。而其他的一些表达升高的蛋白是起到在上游传递外部凋亡信号以及激活蛋白水解酶的作用的。参与线粒体凋亡途径的Apaf-1表达水平的显著降低，以及未发现线粒体凋亡途径相关基因表达的升高，再加上外部凋亡途径TNF受体家族及一些外部凋亡途径调节蛋白基因表达的升高，都说明很可能是通过外部途径(extrinsic pathway)而不是线粒体途径引起细胞的凋亡，并且可能直接或间接抑制了内部凋亡途径(线粒体途径)。还需要在蛋白以及酶活性的水平来进一步证明这一观点。
【参考文献】
1 Gao Y, Zhou S, Jiang W,et al. Effects of ganopoly (a Ganoderma lucidum polysaccharide extract) on the immune functions in advanced-stage cancer patients. Immunol Invest,2003,32(3):201-215.
2 Hsu MJ, Lee SS, Lee ST,et al. Signaling mechanisms of enhanced neutrophil phagocytosis and chemotaxis by the polysaccharide purified from Ganoderma lucidum. Br J Pharmacol,2003,139(2):289-298.
3 Hu H, Ahn NS, Yang X,et al. Ganoderma lucidum extract induces cell cycle arrest and apoptosis in MCF-7 human breast cancer cell. Int J Cancer，2002,102(3):250-253.
4 Lakshmi B, Ajith TA, Sheena N,et al. Antiperoxidative, anti-inflammatory, and antimutagenic activities of ethanol extract of the mycelium of Ganoderma lucidum occurring in South India. Teratog Carcinog Mutagen，2003，1:85-97.
5 Sliva D, Sedlak M, Slivova V,et al.Biologic activity of spores and dried powder from Ganoderma lucidum for the inhibition of highly invasive human Breast and prostate cancer cells. J Altern Complement Med，2003，9(4):491-497.
6 Kimura Y, Taniguchi M, Baba K. Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: mechanism of action and isolation of an active substance. Anticancer Res，2002，22(6A):3309-3318.
7 Zhang HN, He JH, Yuan L,et al. In vitro and in vivo protective effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on alloxan-induced pancreatic islets damage. Life Sci,2003,83(18):2307-2319.
8 Ng PC, Kong YC, Ko KM,et al.Antioxidant activity of Ganoderma Lucidum: protective effects on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity. Acta Horticulture (Netherlands)，1993，332:219-225.
9 Jin H, Zhang G, Cao X,et al. Treatment of hypertension by ling zhi combined with hypotensor and its effects on arterial, arteriolar and capillary pressure and microcirculation. In: Nimmi H, Xiu RJ, Sawada T, Zheng C. (eds). Microcirculatory Approach to Asian Traditional Medicine. New York: Elsevier Science,1996,131.
10 张红梅，田辉凯，姚小皓，等.绿谷灵芝对人脐静脉内皮细胞ICAM-1和VCAM-1表达的影响.中国药理学通报，2002，18(4)：460-464.
11张红梅，姚伟娟，田辉凯，等.绿谷灵芝抑制低密度脂蛋白的氧化及单核细胞对内皮细胞的粘附作用.中国中西医结合杂志，2002，22(7)：534-537.
(编辑：石 岚)
作者单位： 200436 上海，上海大学生命科学学院, 百拇医药(唐犁，李志宏，王涛，吴侯，王沂，郭江宁，翁新楚)