关键词：
大鼠C6脑胶质瘤模型是脑胶质瘤实验研究中应用最为广泛的模型之一[1，2] 。建立此模型的常用方法有2种，即徒手法和立体定向法[3-5] 。我们以此为基础，配以两种细胞悬浮介质即无血清双倍1640和含质量分数为1%琼脂糖的无血清双倍1640，探讨了建立此模型的有效方法。
一、材料和方法
1.材料:成年雄性Wistar大鼠100只，购自本校动物中心；C6胶质瘤细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所；其他物品由本研究所提供。
2.细胞培养与处理：C6胶质瘤细胞以含体积分数为10%新生牛血清(购自Hycolone公司)的1640培养基(购自Gibco公司)常规培养。接种前，收获指数生长期的C6细胞，加入细胞悬浮介质，终浓度为每10μl含106 个C6细胞。
3.接种方法：(1)徒手法[3，4] ：在内眦连线后8 mm、中线向右3mm处钻孔，使用吸有10 μl C6胶质瘤细胞悬液的微量注射器，徒手操作，垂直缓慢进针约4～5mm，注射时间为10 s，注毕停针4～5 s，然后缓慢拔针。(2)立体定向法[4，5] ：立体定向架固定头部，外耳道连线前7 mm、中线向右3 mm处为钻孔位置，利用立体定向架定位并接种细胞。其余步骤同徒手法。
4.动物分组：100只大鼠随机分成5组，前4组分别采用不同的接种方法配以不同的细胞悬浮介质建立模型，并对各组模型的成功率和转移率进行比较。第5组采用含质量分数为1%琼脂糖(购自Dako公司)的无血清双倍1640为细胞悬浮介质，利用立体定向法建立模型，进行C6胶质瘤在大鼠脑内生长情况研究。
5.检测指标及标准：对于前4组，有脑内肿瘤生长迹象的行MRI检查、脑标本HE染色，所有大鼠处死前均作病检。只在脑实质内生长的肿瘤为成功模型，如在脑室、脑外及肺、肝等其他脏器生长的肿瘤均属转移。第5组，定期(12、14、20、24、28d)处死2只，行肿瘤大小检测，其余大鼠观察生存期。
二、结果
我们通过MRI、HE及病检鉴定发现，徒手法无琼脂糖组1，成功率10%，转移率100%；徒手法有琼脂糖组2，成功率50%，转移率60%；立体定向法无琼脂糖组3，成功率80%，转移率30%；立体定向法有琼脂糖组4，成功率100%，转移率0%。从第5组获得的脑标本可以看出，肿瘤在大鼠脑实质中以接种点为中心呈球形生长。接种后12d内大鼠脑内无肉眼可见肿瘤，12 d后脑内肿瘤体积呈指数增大。第5组其余大鼠分别于25～30d死亡，平均生存期28 d，这些大鼠的脑内均可见巨大肿瘤生长，是导致其死亡的主要原因。
三、讨论
我们在本实验中使用了两种接种方法，徒手法操作简单，省时省力，但以右脑顶叶为细胞接种点，距离脑室较近，注射针可能穿入脑室或注射点离脑室太近，致使细胞易于进入脑室及CSF循环系统导致转移[4] ，且定位不准确，操作不稳定。而立体定向法以右脑尾状核为细胞种植点[4，5] ，距离脑室较远，且动物固定好、操作稳定、注射点定位准确。基于上述原因，用立体定向法建立大鼠C6脑胶质瘤模型无论是成功率还是转移率都要好于徒手法，实验结果正说明这一点。Vittorio等[5] 研究发现，注入鼠脑的细胞悬液体积和细胞量均影响此模型的成功率，并证实最适合的接种体积为10μl，细胞为106 个。我们采用此方案，并比较了两种不同的细胞悬浮介质，实验结果表明，加入琼脂糖后不但提高了成功率，还极大降低了转移率。琼脂糖在其中的作用主要是粘附细胞成团，减少细胞向周围脑组织扩散及从针道流出，减少瘤细胞转移[4] 。实验所用低熔点琼脂糖细胞毒性很低，接种后1周左右逐渐被吸收，且脑组织对其无任何不良反应。
本研究结果表明，以含质量数为1%的琼脂糖双倍1640为悬浮介质，采用立体定向法是较为理想的C6脑胶质瘤模型建立方法。用此法不但可建立可靠的模型，而且肿瘤可在大鼠脑内随时间变化而呈规律性生长，具有可预测性，为脑胶质瘤治疗研究的时间点选择提供了参考。
参考文献
[1]Allen M.Biochemicalstudy of tumors of the nervous system.In：Marks N,Rodnight R，eds.Research methods inneurochemistry. New York:Plenum Press.1978.43-55.
[2]San-Galli F,Vrignaud P,Robert J,et al. Assessment of the experimental model oftransplanted C6 glioblastoma in Wistar rats. J Neurooncol, 1989,7:299-304.
[3]Denlinger RH,Axler DA,Koestner A, et al. Tumor-specific transplantation immunity tointracerebral challenge with cells from a methylnitrosourea-induced brain tumor. JMed,1975,6:249-259.
[4]Naoki K,Norman A,Nancy R,et al. An improved brain-tumor model. J Neurosurg,1980,53:808-815.
[5]Vottorio M,Morreale VM,Herman BH,et al.A brain-tumor model utilizing stereotacticimplantation of a permanent cannula. J Neurosurg, 1993,78:959-965.
收稿日期：1999-06-10 , 百拇医药