关键词：胆固醇；内皮细胞；代谢
修瑞娟 段重高 李宏伟 Ingemar Bj
rkhem
目的 研究人体内皮细胞对胆固醇的代谢作用。方法 以体外培养的胎儿脐静脉内皮细胞为实验对象，应用免疫印迹技术、同位素标记技术和气相色谱-质谱分析技术，联合测定胆固醇代谢产物27-羟基胆固醇和3β-羟基-5-胆甾烯酸含量。结果 在内皮细胞培养液中，27-羟基胆固醇和3β-羟基-5-胆甾烯酸含量随培养时间延长而增多；在培养液中加入100 μg外源性胆固醇再培养，上述两种产物含量明显增加；应用氘标记胆固醇证明，大部分产物是由细胞摄取的外源性胆固醇在固醇27-羟化酶的作用下形成的，并且证明体外培养的内皮细胞内含有固醇27-羟化酶。结论 体外培养的人体脐静脉内皮细胞对外源性胆固醇有代谢作用，其路径可能是内皮细胞摄取胆固醇，在固醇27-羟化酶的作用下，生成容易从细胞内转运出来的27-羟基胆固醇和3β-羟基-5-胆甾烯酸。
Elimination of cholesterol in humanendothelial cells Xiu Ruijuan, Duan Chonggao, Li Hongwei, et al. Institute of Microcirculation, Chinese Academy of MedicalSciences, Peking Union Medical College, Beijing 100005
Objective To investigate what role the endothelial cell interfacing withblood components to play in cholesterol metabolism. Methods
Isotopelabeling technique, Gas Chromatography/Mass Spectrometry andWestern blotting were used to measure the presence of 27-oxygenated cholesterol in mediumand the presence of sterol 27-hydroxylase in endothelium. Results When human endothelial cells were cultured in a medium containingfetal calf serum, there was a significant accumulation of 27-hydroxycholesterol and 3β-hydroxy-5-cholesteneic acid, products of cholesterol metabolism,in the medium. The rate of formation of these products almost increased linearly with timeof cultivation. After addition of 100 μg ofextraneous cholesterol to the medium, the accumulation of 27-hydroxy-cholesterol and 3β-hydroxy-5-cholesteneic acid increased significantly. Addition ofmore cholesterol did not further increase the formation of 27-hydroxy-cholesterol andcaused a decrease in the formation of 3β-hydroxy-5-cholesteneicacid. The presence of sterol-27-hydroxylase in the endothelium was demonstrated by Westernblotting. Conclusion Cultured humanendothelium from umbilical veins are able to convert exogenous cholesterol into27-hydroxy-cholesterol and 3β-hydroxy-5-cholesteneicacid. Furthermore, the cells are able to transport these products from the cells into themedium.Key words Endothelial cells Cholesterol Metabolism
(Natl Med J China, 1997, 77：676-679)
在动脉粥样硬化(AS)的形成过程中，内皮细胞起着重要作用。以往的工作早已证明，内皮细胞损伤、血管壁通透性增高，是血脂侵入动脉壁的病理学基础[1] 。高血压、缺氧、高胆固醇血症、血液流变学及血液动力学改变是AS形成的主要发病因素，内皮细胞能够通过产生、释放舒血管物质前列腺素I2 、内皮细胞血管舒张因子和多种细胞因子，改善微循环及机体免疫功能，对AS的形成具有防御作用[2，3] 。本研究的目的是检测内皮细胞对胆固醇有无代谢作用，进一步阐明内皮细胞在AS发病机制中的作用。
材料与方法
一、材料
氘标记及未标记氧化甾醇、三氘标记胆固醇均由瑞典卡洛琳斯卡研究院临床化学部提供。培养液M199、胎牛血清为美国GIBCO/BRL公司产品。兔-人固醇27-羟化酶抗体由David Russell教授(Universityof Texas，USA)馈赠，第二抗体(羊抗兔IgG)为美国Bio-Rad公司产品 。
二、方法
1.内皮细胞培养：参照Jaffe等[4] 的方法分离、培养人脐静脉内皮细胞。用培养液199加20%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺作为内皮细胞生长液。每毫升生长液中含100μg内皮细胞生长因子、100μg青霉素G和100μg链霉素。用2.5%的碳酸氢钠将pH值调节到7.4，过滤除菌备用。
从胎儿脐静脉消化、收集的内皮细胞混悬液在室温下用1 000r/min离心5分钟，弃去上清液，加入内皮细胞生长液，并用滴管吹击，制成均匀的细胞混悬液。最后，将内皮细胞混悬液置入用2%明胶处理过的6孔培养皿中，使每孔含内皮细胞1.5～2×106 个，放入孵箱，在5%CO2 、37℃条件下培养。要加入的外源性胆固醇配成胆固醇乙醇溶液(加入96%乙醇，40℃，振摇至溶液透明)，将培养皿分为 5组，对照组加乙醇溶液8μl，其它4组为外加胆固醇组，每皿加胆固醇乙醇溶液8μl，分别含胆固醇100、200、300、400μg。在培养24、36、72和120小时后，分别收获培养液和内皮细胞备用。
2.细胞培养液提取物的分析：取细胞培养液3ml,加入0.5μg的 3β-羟基-5-胆烯酸和2μg的2 H5 -27-羟基胆固醇。培养液用盐酸酸化，用水稀释到10ml，再用15ml的乙醚提取。醚相用水冲洗直至中性，溶媒在减压条件下移去。存留物溶解在0.5ml的氯仿中，并应用Bond-ElutNH2 柱纯化[5] 。收集其含有27-羟基胆固醇的中性脂质部分及含有3β-羟基-5-胆烯酸和3β-羟基-5-胆甾烯酸的脂肪酸部分。将收集物用氩气吹干，脂肪酸部分用重氮甲烷甲基化，两部分都转移到三甲基硅醚中。
3.气相色谱和质谱分析：将Hewlett-Pakard 5890GC和Hewlett-Pacard5970 MSD质谱计联合使用，气相色谱仪配备25m×0.2mm×0.33μm的Ultra-1柱(Hewlett-Pacard)。时间程序如下：180℃1分钟，以每分钟35℃的速度增加到270℃，然后再以每分钟20℃的速度增加到300℃，这种温度保持20分钟。用2 H5 -27-羟基胆固醇作为27-羟基胆固醇的内标，用3β-羟基-5-胆烯酸作为3β-羟基-5-胆甾烯酸的内标。用选择性离子检测方式(SIM)制作标准曲线并对样本进行定量分析。对于化合物3β-羟基-5-胆烯酸，选择质量/电荷(m/z)460、370和331；对于化合物3β-羟基-5-胆甾烯酸，选择m/z 502、412和373；对于化合物27-羟基胆固醇，选择m/z 546。27-羟基胆固醇和3β-羟基-5-胆甾烯酸中2 H的含量用Biemann的方法计算[6] 。
4.免疫印迹法：应用Laemmli[7] 的方法将细胞匀浆用十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。再用Towbin等[8] 的方法将蛋白质转移到硝酸纤维膜上。用3%明胶PBS溶液封闭1.5小时。对硝酸纤维膜首先应用 第一抗体(稀释1∶1 000)孵育2.5小时，然后用携带辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG(稀释1∶3 000)孵育1小时。最后用显色剂显色。
结果
在人脐静脉内皮细胞正常培养过程中，培养液中27-羟基胆固醇及其氧化产物3β-羟基-5-胆甾烯酸可用气相色谱仪和质谱仪检测出。其含量与细胞培养的时间几乎呈线性关系(图1)。
在培养液中加入100μg外源性胆固醇进行培养的样本中，培养液中27-羟基胆固醇和3β-羟基-5-胆甾烯酸的含量有明显增加。但是，进一步加大外源性胆固醇的量并不能进一步增加上述两种产物的生成，3β-羟基-5-胆甾烯酸的生成反而减少。应用氘标记外源性胆固醇的实验表明，所测得两种产物中氘的相对含量随氘标记胆固醇浓度的增加而增加。当培养液中加入400μg氘标记胆固醇后，培养液中所测得27-羟基胆固醇有50%以上为氘标记者(图2、3)。
图1 内皮细胞(1×106 )培养不同时间其培养液中27-羟化代谢物(27-羟基胆固醇和
3β-羟基-5-胆甾烯酸)的含量，原始数据来自同一胎儿三个培养皿中的内皮细胞。
R1表示R-COOH，R2表示R-CH2 OH，R3表示R-COOH+R-CH2 OH
图2 在内皮细胞(3×106 )培养液中加入不同剂量三氘标记的外源性胆固醇继续培养48小时，
培养液中未被标记(d0 曲线)和被氘标记(d3 曲线)27-羟基胆固醇的含量，原始数据来自同
一胎儿3个培养皿中的内皮细胞
应用免疫印迹法检测证明，内皮细胞匀浆标本可显示一条位于53kDa的清晰的带，与已知人肝脏中的固醇27-羟化酶的显示一致，说明体外培养的人脐静脉内皮细胞中含有固醇27-羟化酶。
图3 在内皮细胞(3×106 )培养液中加入不同剂量三氘标记的外源性胆固醇继续培养48小时，
培养液中未被标记(d0 曲线)和被氘标记(d3 曲线)3β-羟基-5-胆甾烯酸的含量，原始数据来
自同一胎儿三个培养皿中的内皮细胞.
讨论
胆固醇在体内的代谢是一个复杂过程，但其最主要的代谢途径是最终在肝脏内形成胆汁酸，然后随胆汁分泌进入肠道、排出体外。以前的研究已经证明，胆固醇在固醇27-羟化酶的作用下，生成极性更强的27-羟基胆固醇及其氧化产物3β-羟基-5-胆甾烯酸[9] ，它们比胆固醇更容易从细胞内转运出来。在上述反应过程中，固醇27-羟化酶起了关键性作用。固醇27-羟化酶不仅存在于肝脏中，而且广泛存在于多种器官和组织中。因此，可以设想，在胆固醇的代谢过程中，肝脏之外的其他组织也可能发挥重要作用。
血管内皮细胞直接接触循环血液，最先接触外源性胆固醇。因此，研究内皮细胞对胆固醇有无代谢作用对阐明AS发病机制具有重要意义。近年的研究证明，高胆固醇血症可不同程度地损伤内皮细胞功能，甚至可诱导凋亡[10，11] ，但内皮细胞对这种损害因素有无防御机制，对胆固醇有无代谢作用尚不明了。
本研究结果表明，体外培养的人脐静脉内皮细胞能够摄取外源性胆固醇，在其胞体内所含的固醇27-羟化酶作用下生成27-羟基胆固醇及其氧化产物3β-羟基-5-胆甾烯酸，并能将这些产物从细胞内转移到培养液中。据此可以推测，当外源性胆固醇进入机体血液循环后，可能有一部分被内皮细胞摄取，在固醇27-羟化酶作用下生成27-羟基胆固醇和3β-羟基-5-胆甾烯酸，然后这两种产物从内皮细胞转移到循环血液中。
循环血中的27-羟基胆固醇和3β-羟基-5-胆甾烯酸要在肝脏中进一步代谢。肝脏中除了含有丰富的固醇27-羟化酶，还含有对C-27甾醇羟基侧链有高度特异性的氧甾醇7α-羟化酶[12] ，可将经循环进入肝脏的胆固醇及27-氧化胆固醇(主要是27-羟基胆固醇和3β-羟基-5-胆甾烯酸)迅速转化为胆汁酸，最终随胆汁排出体外。
本课题为瑞典国王古斯达夫五世及皇后维多利亚科研基金资助项目
参考文献
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(收稿：1996-10-15 修回：1997-06-17)
, 百拇医药