关键词：凋亡；癌，肝细胞；bcl-2；Fas；FasL配体
【摘要】 目的 探讨bcl-2和Fas/FasL系统在肝癌细胞凋亡过程中的作用。方法 应用免疫组织化学方法检测36例肝癌和49例肝硬化组织中bcl-2、Fas和FasL的表达，用TUNEL法检测肝组织中的细胞凋亡。结果 肝癌组织与肝硬化组织比较，凋亡细胞明显减少；肝癌和肝硬化组织中bcl-2的表达率分别为16.66%和67.34%；Fas的表达率分别为52.77%和73.47%；FasL的表达率分别为72.22%和42.86%。结论 bcl-2在抑制肝癌细胞凋亡过程中可能不起主要作用，而Fas和FasL在肝癌的细胞凋亡调节过程中具有重要作用。
The effect of bcl-2 and Fas/FasL system on hepatic
apoptosis in hepatocellular carcinoma
PENG Zhihai* , HAN Guoxin, TANG Huamei, et al.
( * Department of General Surgery, Shanghai First People's Hospital,
Shanghai 200080,China)
【 Abstract】 Objective To investigate the effect of bcl-2 and Fas/fasL system in the apoptotic process of hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Expression of bcl-2, Fas and FasL in HCC and liver cirrhosis (LC) tissues were detected by immunohistochemical method. Apoptosis was detected by TUNEL method. Results Compared with LC, apoptotic cells in HCC tissues were significantly reduced. Expression rate of bcl-2, Fas and FasL in HCC tissues was 16.66 %, 52.77 % and 72.22 % respectively, and those in LC tissues was 67.34 %, 73.47 % and 42.86 % respectively.Conclusion bcl-2 may not play an important role in the apoptosis of HCC cells, and the Fas/FasL system might play an important role in regulation of apoptosis.
【 Key words】 Apoptosis; Hepatocellular carcinoma; bcl-2; Fas; FasL
肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常密切相关，目前已发现很多基因参与了细胞凋亡过程。本研究旨在探讨bcl-2、Fas、FasL在肝癌、肝硬化组织中的表达及在肝癌细胞凋亡中所起的作用。
材料和方法
1.一般资料：本院1994～1997年肝癌手术切除标本和门静脉高压症病人术中硬化肝活检标本。原发性肝癌36例，其中男31例，女5例，年龄25～74岁；肝硬化49例，其中男30例，女19例，年龄24～65岁。所有组织均立即经体积分数为10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。
2.主要试剂：鼠抗人bcl-2单克隆抗体及Ultra Vision免疫组化检测试剂盒购自美国Neomarkers公司。兔抗人Fas和兔抗人FasL抗体购自美国Santa Cruz公司。Doko EnVision免疫组化检测试剂盒购自丹麦Dako公司。原位末端标记细胞凋亡试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。
3.方法：bcl-2检测采用Ultra Vision免疫组化法检测，Fas、FasL免疫组化检测采用Dako Envision二步法。凋亡检测采用TUNEL法。各项指标检测均严格按试剂盒说明书操作。
4.结果判定：免疫组化根据染色强度、阳性程度分为+～。+：低倍镜视野阳性细胞少于1/3；：低倍镜视野阳性细胞达1/3～2/3；：低倍镜视野阳性细胞大于2/3。凋亡计数，根据阳性细胞分布情况，选择1～3个阳性视野，计数200个细胞中的阳性细胞作为凋亡指数反映凋亡程度。
5.统计学方法：bcl-2、Fas、FasL蛋白表达强度比较采用χ2 检验，细胞凋亡指数比较采用t检验。
结果
1.bcl-2、Fas、FasL在肝癌与肝硬化组织中的表达强度和分布：bcl-2阳性信号位于肝细胞胞浆。肝癌组织中阳性细胞多呈片状分布，肝硬化组织中主要分布于假小叶周边处，亦可呈簇状分布，但在肝硬化组织中的表达明显高于肝癌组织。在肝癌组织中Fas阳性信号主要位于肝细胞胞浆或呈浆膜型，呈散在分布。肝硬化组织中Fas阳性信号主要位于肝细胞胞膜或呈浆膜型，阳性细胞可较少，亦可弥漫分布，部分胆管上皮细胞也可呈阳性。FasL阳性信号主要位于肝细胞胞浆中，在肝癌组织中呈散在或簇状分布，在肝硬化组织中主要分布于碎屑、灶状坏死区周围，有的亦呈弥漫分布(表1)。
表1 肝细胞癌和肝硬化组织中bcl-2、Fas、FasL蛋白表达情况
| 组别 | 例数 | Fas | 阳性率 (%) | FasL | 阳性率 (%) | bcl-2 | 阳性率 (%) | |||||||||
| - | + | - | + | - | + | |||||||||||
| 肝细胞癌 | 36 | 17 | 11 | 3 | 5 | 52.77* | 10 | 15 | 8 | 3 | 72.22* | 30 | 3 | 2 | 1 | 16.66* |
| 肝硬化 | 49 | 13 | 21 | 7 | 8 | 73.47 | 28 | 13 | 6 | 2 | 42.86 | 16 | 22 | 8 | 3 | 67.34 |
注：与肝硬化比较，* P<0.05
2.细胞凋亡在肝癌和肝硬化组织中的分布及密度：阳性信号位于细胞核。肝癌组织中凋亡细胞多为散在分布。肝硬化组织中凋亡细胞多位于假小叶周边近纤维隔处，也见于肝实质内，肝窦内亦可观察到阳性信号，少数病例胆管上皮阳性。21例肝癌组织及22例肝硬化组织的平均凋亡指数分别为2.62±2.33和12.41±6.74，差异有显著性(P<0.001)。
讨论
细胞凋亡障碍是肿瘤发病机制之一[1] 。Fas/APO-1(CD95)、FasL、bcl-2家族、c-myc、p53等基因在细胞凋亡过程均起着不同作用[2] 。我们发现，肝炎后肝硬化组织中肝细胞有较高的bcl-2的表达(67.34%)，且其分布与Fas的分布极为相似，推测bcl-2的高表达可能拮抗由Fas介导的肝细胞凋亡，使硬化肝组织中的细胞凋亡不致过度。而bcl-2在肝癌组织中表达很低(16.66%)，说明bcl-2在抑制肝癌细胞凋亡中可能不起主要作用。本研究结果表明，在肝炎后肝硬化组织中Fas表达率较高，而且同时检测到了肝细胞FasL的表达，而肝癌组织中Fas表达明显下降，FasL的表达明显升高，说明Fas系统参与了肝硬化和肝癌的细胞凋亡过程。在肝癌的形成过程中，细胞凋亡能力下降的原因可能是多方面的。我们认为肝癌细胞凋亡下降可能有以下原因：(1)肝癌细胞功能性FasL的异常高表达，能迅速与浸润至瘤灶部位的CTL上的Fas结合，诱导后者发生凋亡，造成CTL群体的“杀伤势力”消弱，无法构成对肿瘤细胞的杀伤作用，逃避了机体免疫系统对其破坏，使肿瘤细胞得以迅速扩增。(2)肝癌细胞FasL异常高表达的同时，下调或抑制Fas表达，导致机体内依赖Fas介导的CTL(FasL+ )失去杀伤性识别作用，使肿瘤细胞获得异常生存能力。因此，膜形式Fas在凋亡过程中起着重要的作用。总之，在肝硬化转化为肝癌的过程中，细胞凋亡能力的下降是肝癌形成的一个重要因素。肝癌细胞能够逃逸机体的免疫监视，不被机体的免疫系统清除反而迅速增生和扩散，与肝癌细胞表面Fas表达下降及FasL的异常高表达密切相关，而bcl-2的表达与否与肝癌的形成无明显的关系。
基金项目：上海市科学技术发展基金资助项目(98XD14022)
参考文献
[1]Thompsin CB. Apoptosis in pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1462.
[2]Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 1995, 267:1445-1449.
收稿日期：1999-03-16
, http://www.100md.com