幽门螺杆菌疫苗的研究进展
姜政,陶小红, 王丕龙,重庆医科大学第一附属医院消化科 重庆市 400016
黄爱龙,重庆医科大学肝炎研究所 重庆市 400010
项目负责人:姜政,400016, 重庆市渝中区医学院路1号,重庆医科大学第一附属医院消化科. jzho53@mail.china.com.
电话:023-68891218
收稿日期:2002-10-18 接受日期:2002-11-20
摘要幽门螺杆菌是人类最常见的致病菌，也是人类第一类致癌原，他的感染不但与胃肠道疾病有直接关系，而且与肠外疾病的发生也有重要的关系.Hp感染是一种慢性、持续性感染，通过慢性炎症免疫反应、毒素的释放、炎症递质的增多以及自由基的生成，引起感染局部和远处损害，从而导致或加重了胃肠疾病以及肠道外其他系统的疾病.近年来，随着对Hp致病机制进一步认识，根除Hp与胃肠疾病以及胃肠外疾病治疗的关系达成了广泛的共识.目前根除Hp感染虽然有多种有效的药物联合治疗，但同时都存在不同程度的副作用:疗效不稳定、耐药菌株的产生以及难以解决的Hp复发等问题，成为了临床上治疗Hp相关性疾病的几大障碍.随着分子生物学技术的发展，Hp致病机制研究的进一步深入，通过对有效抗原的筛选、抗原释放系统的最佳选择以及基因工程菌株构建的运用，从而为Hp疫苗的研究与开发奠定了基础，同时为预防和根除Hp的感染逐步变成了现实.实验证明，Hp尿素酶、热休克蛋白以及粒细胞激活蛋白等都是有效的抗原成分，配以有效的释放载体，使得实验的动物不同程度地获得了预防和/或根除Hp的感染的能力.现综述近年来Hp疫苗研究报道，为Hp疫苗的开发和研究进一步提供理论依据.
姜政,黄爱龙, 陶小红,王丕龙. 幽门螺杆菌疫苗的研究进展.世界华人消化杂志 2003;11(8):1451-1456
0 引言幽门螺杆菌(Helicobacterpylori ，Hp)是上消化道疾病的主要致病菌，他的感染不但与B型胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤和胃癌的发生有密切关系[1-19]，而且与肠道外疾病的发生也有重要关系[20-36]，已被世界卫生组织列为胃癌等恶性肿瘤发生的相关致病菌[37,38].Hp在我国普通人群的感染率较高达到50-80%，并仍以每年1-2%的速度增加[39]，每年新增感染病例超过1200万人. 根除Hp的感染虽然有多种有效的药物联合治疗，目前采取的方式也很多:比如药物的二联、三联以及四联疗法，既可以达到治疗消化道疾病的目的，同时也不同程度的根除Hp感染.但近年来，由于抗生素广泛的、大剂量的应用以及滥用，导致耐药菌株的产生;同时出现了一些药物副作用;患者耐受性、依从性以及承受力都受到了挑战.鉴于此，欲求降低Hp感染率及其相关疾病的发生率，不少研究工作者正致力于开发新的Hp治疗以及预防方案:Hp疫苗开发，现将Hp疫苗研究进展作一综述.
1 Hp侯选疫苗抗原的选择侯选疫苗的制备必需有效的抗原免疫机体，才能刺激机体产生系统的免疫应答，而后预防机体的感染.随着Hp致病机制研究的深入以及分子生物学技术的发展-基因工程菌株的构建和运用，为有效抗原的筛选提供了有利条件，同时为预防和根除Hp感染迈出了关键的一步.
1.1 尿素酶 尿素酶基因是所有Hp菌株共同拥有的，编码的蛋白具有很强的尿素酶活性，尿素酶占Hp总蛋白量的6%，他是含有镍离子的金属酶，能够分解尿素为NH3和CO2，使Hp周围pH值增高，有利于Hp在低的pH值环境下生存.目前发现尿素酶基因大小约为7.5kb，共有9个读码框(ORF)，分别为UreA、UreB、UreC、UreD、UreE、UreF、UreG、UreH、和UreI.其中UreA、UreB为尿素酶的两个结构亚单位，具有高度的保守性，是PCR检测Hp感染常选择的目的基因以及基因疫苗的侯选基因.实验证明，剔除尿素酶基因表达的Hp，在无菌乳猪感染模型中，Hp感染后不能定植于胃内，这充分证明尿素酶的致病作用;而且能激活单核吞噬细胞和刺激炎性细胞因子的产生，介导胃黏膜上皮炎症反应和空泡形成[40]，也导致胃黏膜上皮的增生与凋亡失衡，增生指数(LI)/凋亡指数(AI)明显增高，导致癌前病变的发生，同时在体外仍然对胃上皮细胞有毒力作用.另外铵离子会干扰胃黏膜的正常H+反渗，导致组织损伤，细菌过度的生长，硝酸盐降解为亚硝酸盐及亚硝胺而致癌.因此，尿素酶既是定植因子，又是毒力因子[41].虽然尿素酶对Hp的定植和致病起着重要的作用，但由于其主要活性部分位于菌体表面、含量丰富、广泛表达、高度保守、其大分子量和颗粒状结构有利于黏膜免疫接种，因此，尿素酶分子是作为疫苗抗原的合理选择[42,43].同时在体内，Hp表面具有黏附胞质蛋白的特性，能够将自溶释放的尿素酶黏附到活菌表面，这给Hp疫苗的研究又提供了一重要的理论依据.
大量的文献报道，用重组的尿素酶亚单位B(rUreB)口服免疫预先感染了Hf小鼠，结果发现免疫的小鼠不仅彻底清除了Hf感染，而且能够预防小鼠再次感染;Kleanthous et al [44]用重组的尿素酶亚单位B(rUreB)加上大肠杆菌热不稳定毒素(LT)作为黏膜佐剂免疫小鼠，与对照组相比，结果发现:免疫组胃内Ure活性显著降低，且胃黏膜组织Hp定量培养显示，Hp减少97%以上;Michetti et al [45]对口服不同剂量(180mg、60 mg、20mg，4次/d)的尿素酶与LT(5mg)安全性和免疫原性进行了研究，结果发现:所有的志愿者都能够耐受，且能够减少胃内Hp的定植，从而减轻了胃炎的程度;Saldinger et al [46] 采用rUreB结合霍乱毒素(CT)免疫感染了HfBALB/c小鼠，结果发现免疫BALB/c小鼠全部清除了Hf，进一步研究表明，脾脏CD4+T细胞增生，血清中lgG1增加，同时伴随IL-4的增高，g-干扰素的减少，从而推测rUreB可能诱导了Th-2CD4+T细胞增生，有助于Hp的根除.有学者对Hp感染志愿者进行了I-II期临床实验，用Ure结合LT免疫后，同样发现Hp感染的密度显著减少;Lee et al [47]对非人灵长类进行的类似研究也表明，通过减少胃内Hp的密度，有助于减轻胃炎的程度.然而，Solnicket al [48]报道，用尿素酶口服和肌肉注射免疫类人猿，而后进行Hp攻击，结果发现:虽然能够诱导体液免疫，但是所有给与Hp攻击的类人猿都感染了Hp，而且细菌密度在实验组和对照组中没有统计学差异.上述结果显示，Hp疫苗有待于进一步研究.为了获得较好的免疫效果，因而建议多种抗原成分联合起来制作疫苗.
1.2 空泡毒素 由VacA基因所表达，VacA基因存在于所有Hp菌株的基因组中，目前发现VacA至少存在4个不同信号区(sla、slb、slc、s2)和3个不同的中间区(ml、m2a、m2b).VacA由一个信号区及一个中间区组成，因此VacA有多种不同的组合体.不同的组合体其空泡毒性有极大的差异，因此，导致胃、十二指肠疾病的关系也存在极大的差异.所表达的活性毒素可在loop区降解而产生两个分子量分别为37kD、58 kD的亚单位，一般认为，37kD亚单位为VacAAB型结构毒素的A亚单位，是毒素亚单位;而58 kD亚单位则为B亚单位，主要是与靶细胞结合的亚单位.在体外，只有50-60% Hp产生具有活性的VacA.研究认为，VacA毒素能黏附靶细胞，并被靶细胞内化，在细胞内表达而产生空泡作用;也有研究认为，VacA可能是通过作用于细胞膜上的Na+-K+-ATP酶，影响离子间转运而引起细胞的空泡样变性;有文献报道，VacA毒素能够抑制表皮生长因子(EGF)与其受体的结合，从而引起酪氨酸磷酸化，扰乱了上皮细胞的信号传导，使上皮损害[49];研究还表明，去毒的空泡毒素(VacA)免疫小鼠，能够使小鼠免受产VacA毒素的Hp感染.Ghiara et al [50]应用rVacA和CagA作为抗原与LTK63黏膜佐剂免疫小鼠，结果该疫苗成功地根除了小鼠Hp的感染，从而认为以VacA和CagA为基础的抗原疫苗对小鼠慢性Hp感染具有确切的治疗和预防作用，这为该疫苗应用于人类的临床研究奠定了基础.
1.3 CagA蛋白 CagA基因也称为细胞毒素相关基因，其表达产物为CagA蛋白.后者为120-128kD高分子的蛋白，是Hp产生的另一重要毒力因子.具有CagA基因的Hp几乎都表达CagA蛋白并产生可测的抗体反应.据文献报道，CagA阳性菌株能够直接或间接(通过NF-kB)诱导胃上皮细胞IL-8的分泌，而IL-8在中性粒细胞趋化和激活过程中起重要作用，导致胃黏膜的损伤.动物实验发现，CagA基因和CagA蛋白与胃炎、消化性溃疡、尤其胃癌的发生有良好的相关性[51].在CagA阳性的Hp菌株中还发现某些Hp染色体上存在特定的DNA区域，与致病相关，具有致病岛特征，称之为Cag致病岛(pathogenecityisland，PAI).Cag PAI 约4万bp的DNA片段，含有30多个基因，依次命名为CagA、CagB、CagC…CagT等.Cag PAI部分基因序列与一些已知致病毒力基因序列有高度同源性，所以提示CagPAI是Hp主要毒力因子.关于CagPAI多态性、致病性与其疫苗正在探讨中.
1.4 中性白细胞激活蛋白(NAP) NAP是一种铁蛋白，编码他的NAPn基因几乎在所有Hp中检测到，但是在体外表达的NAP，其活性存在很大差异.他能够通过CD11a/CD18和CD11b/CD18与ICAM-1相互作用而使白细胞黏附内皮细胞;选择性地与中性白细胞的酸性糖鞘脂相结合而调节白细胞的功能;与粘蛋白相结合，为Hp定植于胃黏膜上皮细胞埋下了伏笔，因此，NAP在其黏附和致病过程中起重要作用[52].进一步研究发现，NAP也是一种Hp疫苗的侯选抗原，rNAP免疫小鼠能够使小鼠获得免疫力.Satin et al [53]采用HpNAP接种小鼠，能够诱导体液免疫，使小鼠对Hp具有免疫力，但同时发现HpNAP对淋巴细胞等具有化学趋化作用，导致炎症细胞在Hp感染部位聚集，同时激活NADPH氧化酶，产生一些氧自由基，导致机体的损害.
1.5 热休克蛋白60(HSP60) 热休克蛋白家族有HspA、B，Hsp60，Hsp70等，研究发现，这些蛋白质中Hsp60和HopZ(Hpouter membrane protein Z)与Hp的黏附有关，Hp热休克蛋白HspA、HspB，分别同源于大肠杆菌的GroEs和GroEI.体外实验表明，热休克蛋白可增强尿素酶的活性作用，同时与自身免疫性反应相关，这样就有可能产生有害的自身反应性抗体，动物实验还证明，以热休克蛋白喂养小鼠可引起冠状动脉粥样硬化[54]，但用其免疫动物能够使动物获得对Hp的免疫力.Todoroki et al [55]制备了编码热休克蛋白A、B的DNA(pcDNA3.1-hspA和pcDNA3.1-hspB)疫苗，对C57BL小鼠进行皮下接种，采用pcDNA3.1-hspA接种的C57BL小鼠产生了IgG2a，pcDNA3.1-hspB则产生IgG1/IgG2a，他们都显著地减少Hp在胃内的定植，同时减轻因Hp存在的炎症反应.因而，作者认为:以热休克蛋白为基础的DNA疫苗不失为一种有效的Hp疫苗.
1.6 黏附蛋白 1993年，Evanset al发现，在Hp上存在一种原纤维样血凝素(NLBH)能与人红细胞紧密结合，并通过血凝抑制试验证实N-乙酰神经氨酰乳糖是其受体的主要成分，随后克隆了相应的基因HpaA，发现基因长度约为1.4kb，存在3个读码框(ORF),其中ORF2长度为549bp，是NLBH的主要结构基因-HpaA.后来有学者[56]提出异议，认为HpaA长为783bp，包含了Evans所述的ORF2和ORF3，编码2.9万的蛋白质，我国学者[57]通过克隆并序列分析证实HpaA长为783bp，编码261个氨基酸残基，在大肠杆菌中表达具有良好的抗原性.Hp黏附蛋白对Hp的定植和致病起着重要的作用.Chen et al [58]报道，采用rHpaA进行体外实验，rHpaA能够被Hp阳性患者血清识别，同时能够刺激外周不同的Th细胞增生，更重要的是rHpaA能够增加Th2细胞的比例，而且发现rHpaA和抗HpaA能够抑制Hp在胃黏膜上黏附.因此，作者认为rHpaA可能将成为Hp一种新的侯选抗原.Kim et al [59]构建重组质粒编码HpaA和霍乱毒素CTXA2B基因，在大肠杆菌中表达，经过纯化口服免疫小鼠，结果发现:重组融合蛋白能够提高黏膜的IgA以及血清中IgG的含量，同时使62.5%的小鼠具有预防Hp感染的能力.
1.7 全菌抗原 Doidge et al用Hp超声粉碎抗原和黏膜免疫佐剂口服免疫小鼠，使感染的小鼠不仅清除了体内的Hp，同时获得了预防Hp再感染的能力.但全菌抗原成分复杂，副反应多，而且存在由交叉反应引起一系列不良反应的可能性，然而用单一的抗原，免疫原性太弱，故多采用2-3种不同的抗原联合应用以克服上述两种疫苗的不足之处，以期待获得更广泛地预防和免疫治疗作用的疫苗.Kotloff et al [60]采用灭活的Hp全菌和免疫佐剂口服免疫有或没有临床症状志愿者，结果发现能够同时诱导黏膜和体液免疫.Goto et al [61]用全菌超声破碎液加霍乱毒素以不同的剂量口服免疫C57BL/6，而后用活的Hp进行攻击，通过对胃黏膜炎症反应程度观察、唾液以及粪便中IgA检测、Hp定植程度等研究，发现全菌超声破碎液能够刺激黏膜免疫，使90-100% Hp定植受到了抑制，所有被保护的小鼠胃黏膜都表达g-干扰素，50%小鼠还表达IL-4、IL-5，但同时发现免疫后小鼠胃炎程度比免疫前更严重，作者认为可能与免疫有关.Ikewaki et al [62]对持续Hp感染小鼠进行Hp全菌超声破碎液加CT免疫，通过细菌培养、组织学检测，结果发现:62.5 %的小鼠根除了Hp，有趣的是单用CT免疫的小鼠，47.1%消除了Hp的感染，同时还发现唾液以及粪便中IgA、胃黏膜IL-4表达也是增高的，这可能与Th2细胞的激活有关.
2 Hp侯选疫苗佐剂的选择为了解决蛋白质疫苗普遍存在抗原性弱的问题，以往常配以黏膜佐剂，而霍乱毒素(CT)和大肠杆菌热敏毒素(LT)是目前研究最为深入的黏膜免疫佐剂，可促进抗原呈递细胞的抗原呈递，刺激Th2型黏膜免疫，活化Th2细胞免疫途径，促进上皮细胞内淋巴细胞的有丝分裂和B细胞种型分化，克服了因抗原的免疫耐受而起免疫促进作用.虽然口服疫苗是一种较为理想的免疫接种途径，但实验表明，口服黏膜佐剂可产生不同程度的副作用，CT可诱生超敏反应以及LT的毒力所致腹泻等不耐受症状.经过不断的探索和研究，目前开发了更为安全而有效的黏膜免疫佐剂.
2.1 霍乱毒素(choleratoxin，CT) CT是一种强有力的免疫佐剂，其作用机制是通过抑制口服抗原的免疫耐受而发挥免疫促进作用，但由于毒性作用的存在-超敏反应等，使他的应用受到了一定的限制.研究发现，具有两个亚基A2、B的CT，通过生物学的改造后，具有毒副作用小的特点，因而得到了广泛的应用.CT-B具有增强免疫作用，目前认为CT-B是至今为止最有效最安全的黏膜免疫佐剂之一，多数研究学者将CT-B与Hp的重组抗原结合起来免疫小鼠，可使小鼠获得免疫力.
2.2 大肠杆菌热敏毒素(LT) 目前最受青昧的黏膜免疫佐剂是LT-B，因为LT-B比CT-B拥有更可靠的安全性和有效性.实验发现，与Hp的重组抗原结合，免疫小鼠几乎不出现副作用.Pizza et al [63]报道:CT和LT虽然是强的免疫佐剂，但在人体实验中发现，具有很大的副作用.目前，通过大量的实验研究，将LT的A亚单位第63位的赖氨酸被丝氨酸取代，开发出无毒副作用的LTK63，以及第72位的精氨酸被丙氨酸取代保留了部分酶活性LTR72，二者都具有黏膜免疫佐剂的作用，与有效的抗原一起，刺激机体产生强的免疫力.
3 Hp侯选疫苗释放系统的选择某些载体(细菌或质粒)，经过分子生物学改造以后，具有无比的优越性-独特的安全性和免疫佐剂的作用而受到科学家们的关注.
3.1 真核表达载体pcDNA3.1(+) 核酸疫苗(DNA疫苗)是1990年初发展起来的一种全新的第三代疫苗，因其不仅能诱导体液免疫及细胞免疫，而且还具有容易构建与改造，制备工艺简单等传统疫苗难以比拟的优点，而受到普遍重视.据文献报道，注入的DNA可以达到机体的其他部位，且能被多种细胞摄取DNA质粒，而进入细胞，这为DNA疫苗奠定了基础.pcDNA3.1(+)作为研究工具，将Hp侯选抗原基因克隆至pcDNA3.1(+)，探讨其在真核细胞表达的情况.实验结果表明，Hp侯选抗原能在真核细胞中表达，并能使接种的动物获得对Hp的免疫力.国内外已报道了HpUreB及HspA2B核酸疫苗的构建，初步证明了其免疫原性及免疫保护作用[55].
3.2 减毒的沙门菌 Koesling et al [64]采用重组的尿素酶A、B的减毒沙门菌(SL3261[pYZ97])单剂量口服免疫BALB/c、C57BL/6小鼠，能够产生持久的免疫力，攻击实验表明，重组减毒沙门菌疫苗既能够预防Hp感染，而且能够治疗Hp的感染.Bumann et al [65]研究发现，尿素酶能够在重组减毒沙门菌Ty21a(pDB1)中表达，同时对9位志愿者和3位志愿者分别接种了Ty21a(pDB1)和Ty21a，结果发现:没有严重的副作用发生，12位志愿者中有10位针对沙门菌产生了体液免疫反应，3位产生了针对尿素酶的T细胞的免疫反应，因此作者认为重组减毒沙门菌疫苗是以T细胞介导的保护性的免疫反应.Liao et al [66]探索了表达Hp过氧化氢酶的减毒沙门菌疫苗(SL3261)的作用，通过口服，将其免疫C57BL/6小鼠，随后给予Hp悉尼菌株攻击，结果发现:该疫苗能诱导有效地免疫反应，预防和治疗Hp的感染.通过以上实验说明，减毒沙门菌不仅是一种有效的免疫载体，而且能刺激细胞免疫和诱导体液免疫.
3.3 乳酸杆菌 研究表明，乳酸杆菌是肠道的正常菌群，同时可以作为一种载体表达菌，他能够表达Hp的各种成分.Leeet al [67]报道，通过将Hp尿素酶基因克隆至载体pTREX1，转染乳酸杆菌，而后表达尿素酶，构建了乳酸杆菌MG1363疫苗，可溶性表达尿素酶，占菌体总量的6.25%，以不同剂量、方案口服免疫C57BL/6，结果发现:乳酸杆菌MG1363疫苗能够诱导体液免疫而起保护作用.
3.4 卡介苗(BCG) 以往主要用于预防结核菌的感染，由于是活载体及其独特的安全性和免疫佐剂作用而近来受到科学家们的关注，经过分子生物学改造以后，已构建出能在BCG中表达外源基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒.现研究表明:重组BCG(rBCG)能够表达IL-12、IFN-g、GM-CSF、HCG-b，且能被机体识别，可用于人类的生物治疗.重组BCG技术已经作为一种分子生物学技术广泛用于疫苗、肿瘤、治疗等领域[68-79].具有其他疫苗载体不可比拟的优越性，即毒副作用小、安全、生产工艺简单，不需要纯化，成本低，本身就是很强的免疫佐剂，一次性接种，终身带菌，可使机体产生长期的细胞免疫和体液免疫，因而该疫苗是一种理想、高效、特异的疫苗，他将预防和治疗于一体.如果外源基因在BCG中过度表达，还可以通过体外干预的方法终止其过度表达.目前我们正在构建重组BCG-Hp/OMP，以期待获得一种理想的疫苗.
4 Hp疫苗的免疫保护机制目前Hp疫苗诱导机体产生保护性免疫和治疗作用的机制仍不清楚.Saldinger et al [46]采用rUreB结合霍乱毒素(CT)免疫BALB/c小鼠，研究发现，脾脏CD4+T细胞增生，血清中lgG1增加，同时伴随IL-4的增高，g-干扰素的减少，从而推测rUreB可能诱导了Th2CD4+T细胞增生，有助于Hp的根除.Ghiara et al [50]认为Hp疫苗可能改变了胃内Th1型应答反应，通过Th2或Th0型起保护性反应，而Th1型应答反应产生IFN-g、IL-12等细胞因子引起黏膜的损害，而Th2或Th0免疫应答则引起体液免疫反应，产生S-IgA以及IL-4、IL-10等细胞因子而起免疫保护作用，也有研究表明[80]，Th1型免疫反应同时也参与了免疫保护机制，Th1和Th2的平衡协调可能对疫苗的保护机制更为重要.Blanchard et al [81]报道，通过对人和动物长期的研究发现，Hp引起内在免疫反应的能力受到宿主基因框架的调节，也就是说，机体的免疫状态对Hp根除或者加重Hp所致的胃肠道疾病起了决定性的作用.
5 Hp疫苗的未来Hp疫苗的研究虽然取得了显著的进展，预计将有商品化的Hp疫苗进入临床实验，但是Hp疫苗成功地应用于人类预防和临床治疗尚有许多困难有待解决;尚有许多工作有待深入:(1)进一步需要阐明人体感染Hp后地免疫应答和疫苗免疫保护机制，为疫苗的设计及免疫策略提供依据;(2)进一步筛选更为有效的抗原制备疫苗和研制更完善的核酸疫苗;(3)研制更安全有效的疫苗运载释放系统及有效的免疫接种途径;(4)建立更能客观评价疫苗免疫效果的动物模型等.Hp疫苗的研制已成为全球研究的热点，美国已将其列为21世纪疫苗优先发展的II类项目，有人预测在2010年代，Hp疫苗将有选择地应用于人群的预防和临床治疗.
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黄爱龙,重庆医科大学肝炎研究所 重庆市 400010
项目负责人:姜政,400016, 重庆市渝中区医学院路1号,重庆医科大学第一附属医院消化科. jzho53@mail.china.com.
电话:023-68891218
收稿日期:2002-10-18 接受日期:2002-11-20
摘要幽门螺杆菌是人类最常见的致病菌，也是人类第一类致癌原，他的感染不但与胃肠道疾病有直接关系，而且与肠外疾病的发生也有重要的关系.Hp感染是一种慢性、持续性感染，通过慢性炎症免疫反应、毒素的释放、炎症递质的增多以及自由基的生成，引起感染局部和远处损害，从而导致或加重了胃肠疾病以及肠道外其他系统的疾病.近年来，随着对Hp致病机制进一步认识，根除Hp与胃肠疾病以及胃肠外疾病治疗的关系达成了广泛的共识.目前根除Hp感染虽然有多种有效的药物联合治疗，但同时都存在不同程度的副作用:疗效不稳定、耐药菌株的产生以及难以解决的Hp复发等问题，成为了临床上治疗Hp相关性疾病的几大障碍.随着分子生物学技术的发展，Hp致病机制研究的进一步深入，通过对有效抗原的筛选、抗原释放系统的最佳选择以及基因工程菌株构建的运用，从而为Hp疫苗的研究与开发奠定了基础，同时为预防和根除Hp的感染逐步变成了现实.实验证明，Hp尿素酶、热休克蛋白以及粒细胞激活蛋白等都是有效的抗原成分，配以有效的释放载体，使得实验的动物不同程度地获得了预防和/或根除Hp的感染的能力.现综述近年来Hp疫苗研究报道，为Hp疫苗的开发和研究进一步提供理论依据.
姜政,黄爱龙, 陶小红,王丕龙. 幽门螺杆菌疫苗的研究进展.世界华人消化杂志 2003;11(8):1451-1456
0 引言幽门螺杆菌(Helicobacterpylori ，Hp)是上消化道疾病的主要致病菌，他的感染不但与B型胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤和胃癌的发生有密切关系[1-19]，而且与肠道外疾病的发生也有重要关系[20-36]，已被世界卫生组织列为胃癌等恶性肿瘤发生的相关致病菌[37,38].Hp在我国普通人群的感染率较高达到50-80%，并仍以每年1-2%的速度增加[39]，每年新增感染病例超过1200万人. 根除Hp的感染虽然有多种有效的药物联合治疗，目前采取的方式也很多:比如药物的二联、三联以及四联疗法，既可以达到治疗消化道疾病的目的，同时也不同程度的根除Hp感染.但近年来，由于抗生素广泛的、大剂量的应用以及滥用，导致耐药菌株的产生;同时出现了一些药物副作用;患者耐受性、依从性以及承受力都受到了挑战.鉴于此，欲求降低Hp感染率及其相关疾病的发生率，不少研究工作者正致力于开发新的Hp治疗以及预防方案:Hp疫苗开发，现将Hp疫苗研究进展作一综述.
1 Hp侯选疫苗抗原的选择侯选疫苗的制备必需有效的抗原免疫机体，才能刺激机体产生系统的免疫应答，而后预防机体的感染.随着Hp致病机制研究的深入以及分子生物学技术的发展-基因工程菌株的构建和运用，为有效抗原的筛选提供了有利条件，同时为预防和根除Hp感染迈出了关键的一步.
1.1 尿素酶 尿素酶基因是所有Hp菌株共同拥有的，编码的蛋白具有很强的尿素酶活性，尿素酶占Hp总蛋白量的6%，他是含有镍离子的金属酶，能够分解尿素为NH3和CO2，使Hp周围pH值增高，有利于Hp在低的pH值环境下生存.目前发现尿素酶基因大小约为7.5kb，共有9个读码框(ORF)，分别为UreA、UreB、UreC、UreD、UreE、UreF、UreG、UreH、和UreI.其中UreA、UreB为尿素酶的两个结构亚单位，具有高度的保守性，是PCR检测Hp感染常选择的目的基因以及基因疫苗的侯选基因.实验证明，剔除尿素酶基因表达的Hp，在无菌乳猪感染模型中，Hp感染后不能定植于胃内，这充分证明尿素酶的致病作用;而且能激活单核吞噬细胞和刺激炎性细胞因子的产生，介导胃黏膜上皮炎症反应和空泡形成[40]，也导致胃黏膜上皮的增生与凋亡失衡，增生指数(LI)/凋亡指数(AI)明显增高，导致癌前病变的发生，同时在体外仍然对胃上皮细胞有毒力作用.另外铵离子会干扰胃黏膜的正常H+反渗，导致组织损伤，细菌过度的生长，硝酸盐降解为亚硝酸盐及亚硝胺而致癌.因此，尿素酶既是定植因子，又是毒力因子[41].虽然尿素酶对Hp的定植和致病起着重要的作用，但由于其主要活性部分位于菌体表面、含量丰富、广泛表达、高度保守、其大分子量和颗粒状结构有利于黏膜免疫接种，因此，尿素酶分子是作为疫苗抗原的合理选择[42,43].同时在体内，Hp表面具有黏附胞质蛋白的特性，能够将自溶释放的尿素酶黏附到活菌表面，这给Hp疫苗的研究又提供了一重要的理论依据.
大量的文献报道，用重组的尿素酶亚单位B(rUreB)口服免疫预先感染了Hf小鼠，结果发现免疫的小鼠不仅彻底清除了Hf感染，而且能够预防小鼠再次感染;Kleanthous et al [44]用重组的尿素酶亚单位B(rUreB)加上大肠杆菌热不稳定毒素(LT)作为黏膜佐剂免疫小鼠，与对照组相比，结果发现:免疫组胃内Ure活性显著降低，且胃黏膜组织Hp定量培养显示，Hp减少97%以上;Michetti et al [45]对口服不同剂量(180mg、60 mg、20mg，4次/d)的尿素酶与LT(5mg)安全性和免疫原性进行了研究，结果发现:所有的志愿者都能够耐受，且能够减少胃内Hp的定植，从而减轻了胃炎的程度;Saldinger et al [46] 采用rUreB结合霍乱毒素(CT)免疫感染了HfBALB/c小鼠，结果发现免疫BALB/c小鼠全部清除了Hf，进一步研究表明，脾脏CD4+T细胞增生，血清中lgG1增加，同时伴随IL-4的增高，g-干扰素的减少，从而推测rUreB可能诱导了Th-2CD4+T细胞增生，有助于Hp的根除.有学者对Hp感染志愿者进行了I-II期临床实验，用Ure结合LT免疫后，同样发现Hp感染的密度显著减少;Lee et al [47]对非人灵长类进行的类似研究也表明，通过减少胃内Hp的密度，有助于减轻胃炎的程度.然而，Solnicket al [48]报道，用尿素酶口服和肌肉注射免疫类人猿，而后进行Hp攻击，结果发现:虽然能够诱导体液免疫，但是所有给与Hp攻击的类人猿都感染了Hp，而且细菌密度在实验组和对照组中没有统计学差异.上述结果显示，Hp疫苗有待于进一步研究.为了获得较好的免疫效果，因而建议多种抗原成分联合起来制作疫苗.
1.2 空泡毒素 由VacA基因所表达，VacA基因存在于所有Hp菌株的基因组中，目前发现VacA至少存在4个不同信号区(sla、slb、slc、s2)和3个不同的中间区(ml、m2a、m2b).VacA由一个信号区及一个中间区组成，因此VacA有多种不同的组合体.不同的组合体其空泡毒性有极大的差异，因此，导致胃、十二指肠疾病的关系也存在极大的差异.所表达的活性毒素可在loop区降解而产生两个分子量分别为37kD、58 kD的亚单位，一般认为，37kD亚单位为VacAAB型结构毒素的A亚单位，是毒素亚单位;而58 kD亚单位则为B亚单位，主要是与靶细胞结合的亚单位.在体外，只有50-60% Hp产生具有活性的VacA.研究认为，VacA毒素能黏附靶细胞，并被靶细胞内化，在细胞内表达而产生空泡作用;也有研究认为，VacA可能是通过作用于细胞膜上的Na+-K+-ATP酶，影响离子间转运而引起细胞的空泡样变性;有文献报道，VacA毒素能够抑制表皮生长因子(EGF)与其受体的结合，从而引起酪氨酸磷酸化，扰乱了上皮细胞的信号传导，使上皮损害[49];研究还表明，去毒的空泡毒素(VacA)免疫小鼠，能够使小鼠免受产VacA毒素的Hp感染.Ghiara et al [50]应用rVacA和CagA作为抗原与LTK63黏膜佐剂免疫小鼠，结果该疫苗成功地根除了小鼠Hp的感染，从而认为以VacA和CagA为基础的抗原疫苗对小鼠慢性Hp感染具有确切的治疗和预防作用，这为该疫苗应用于人类的临床研究奠定了基础.
1.3 CagA蛋白 CagA基因也称为细胞毒素相关基因，其表达产物为CagA蛋白.后者为120-128kD高分子的蛋白，是Hp产生的另一重要毒力因子.具有CagA基因的Hp几乎都表达CagA蛋白并产生可测的抗体反应.据文献报道，CagA阳性菌株能够直接或间接(通过NF-kB)诱导胃上皮细胞IL-8的分泌，而IL-8在中性粒细胞趋化和激活过程中起重要作用，导致胃黏膜的损伤.动物实验发现，CagA基因和CagA蛋白与胃炎、消化性溃疡、尤其胃癌的发生有良好的相关性[51].在CagA阳性的Hp菌株中还发现某些Hp染色体上存在特定的DNA区域，与致病相关，具有致病岛特征，称之为Cag致病岛(pathogenecityisland，PAI).Cag PAI 约4万bp的DNA片段，含有30多个基因，依次命名为CagA、CagB、CagC…CagT等.Cag PAI部分基因序列与一些已知致病毒力基因序列有高度同源性，所以提示CagPAI是Hp主要毒力因子.关于CagPAI多态性、致病性与其疫苗正在探讨中.
1.4 中性白细胞激活蛋白(NAP) NAP是一种铁蛋白，编码他的NAPn基因几乎在所有Hp中检测到，但是在体外表达的NAP，其活性存在很大差异.他能够通过CD11a/CD18和CD11b/CD18与ICAM-1相互作用而使白细胞黏附内皮细胞;选择性地与中性白细胞的酸性糖鞘脂相结合而调节白细胞的功能;与粘蛋白相结合，为Hp定植于胃黏膜上皮细胞埋下了伏笔，因此，NAP在其黏附和致病过程中起重要作用[52].进一步研究发现，NAP也是一种Hp疫苗的侯选抗原，rNAP免疫小鼠能够使小鼠获得免疫力.Satin et al [53]采用HpNAP接种小鼠，能够诱导体液免疫，使小鼠对Hp具有免疫力，但同时发现HpNAP对淋巴细胞等具有化学趋化作用，导致炎症细胞在Hp感染部位聚集，同时激活NADPH氧化酶，产生一些氧自由基，导致机体的损害.
1.5 热休克蛋白60(HSP60) 热休克蛋白家族有HspA、B，Hsp60，Hsp70等，研究发现，这些蛋白质中Hsp60和HopZ(Hpouter membrane protein Z)与Hp的黏附有关，Hp热休克蛋白HspA、HspB，分别同源于大肠杆菌的GroEs和GroEI.体外实验表明，热休克蛋白可增强尿素酶的活性作用，同时与自身免疫性反应相关，这样就有可能产生有害的自身反应性抗体，动物实验还证明，以热休克蛋白喂养小鼠可引起冠状动脉粥样硬化[54]，但用其免疫动物能够使动物获得对Hp的免疫力.Todoroki et al [55]制备了编码热休克蛋白A、B的DNA(pcDNA3.1-hspA和pcDNA3.1-hspB)疫苗，对C57BL小鼠进行皮下接种，采用pcDNA3.1-hspA接种的C57BL小鼠产生了IgG2a，pcDNA3.1-hspB则产生IgG1/IgG2a，他们都显著地减少Hp在胃内的定植，同时减轻因Hp存在的炎症反应.因而，作者认为:以热休克蛋白为基础的DNA疫苗不失为一种有效的Hp疫苗.
1.6 黏附蛋白 1993年，Evanset al发现，在Hp上存在一种原纤维样血凝素(NLBH)能与人红细胞紧密结合，并通过血凝抑制试验证实N-乙酰神经氨酰乳糖是其受体的主要成分，随后克隆了相应的基因HpaA，发现基因长度约为1.4kb，存在3个读码框(ORF),其中ORF2长度为549bp，是NLBH的主要结构基因-HpaA.后来有学者[56]提出异议，认为HpaA长为783bp，包含了Evans所述的ORF2和ORF3，编码2.9万的蛋白质，我国学者[57]通过克隆并序列分析证实HpaA长为783bp，编码261个氨基酸残基，在大肠杆菌中表达具有良好的抗原性.Hp黏附蛋白对Hp的定植和致病起着重要的作用.Chen et al [58]报道，采用rHpaA进行体外实验，rHpaA能够被Hp阳性患者血清识别，同时能够刺激外周不同的Th细胞增生，更重要的是rHpaA能够增加Th2细胞的比例，而且发现rHpaA和抗HpaA能够抑制Hp在胃黏膜上黏附.因此，作者认为rHpaA可能将成为Hp一种新的侯选抗原.Kim et al [59]构建重组质粒编码HpaA和霍乱毒素CTXA2B基因，在大肠杆菌中表达，经过纯化口服免疫小鼠，结果发现:重组融合蛋白能够提高黏膜的IgA以及血清中IgG的含量，同时使62.5%的小鼠具有预防Hp感染的能力.
1.7 全菌抗原 Doidge et al用Hp超声粉碎抗原和黏膜免疫佐剂口服免疫小鼠，使感染的小鼠不仅清除了体内的Hp，同时获得了预防Hp再感染的能力.但全菌抗原成分复杂，副反应多，而且存在由交叉反应引起一系列不良反应的可能性，然而用单一的抗原，免疫原性太弱，故多采用2-3种不同的抗原联合应用以克服上述两种疫苗的不足之处，以期待获得更广泛地预防和免疫治疗作用的疫苗.Kotloff et al [60]采用灭活的Hp全菌和免疫佐剂口服免疫有或没有临床症状志愿者，结果发现能够同时诱导黏膜和体液免疫.Goto et al [61]用全菌超声破碎液加霍乱毒素以不同的剂量口服免疫C57BL/6，而后用活的Hp进行攻击，通过对胃黏膜炎症反应程度观察、唾液以及粪便中IgA检测、Hp定植程度等研究，发现全菌超声破碎液能够刺激黏膜免疫，使90-100% Hp定植受到了抑制，所有被保护的小鼠胃黏膜都表达g-干扰素，50%小鼠还表达IL-4、IL-5，但同时发现免疫后小鼠胃炎程度比免疫前更严重，作者认为可能与免疫有关.Ikewaki et al [62]对持续Hp感染小鼠进行Hp全菌超声破碎液加CT免疫，通过细菌培养、组织学检测，结果发现:62.5 %的小鼠根除了Hp，有趣的是单用CT免疫的小鼠，47.1%消除了Hp的感染，同时还发现唾液以及粪便中IgA、胃黏膜IL-4表达也是增高的，这可能与Th2细胞的激活有关.
2 Hp侯选疫苗佐剂的选择为了解决蛋白质疫苗普遍存在抗原性弱的问题，以往常配以黏膜佐剂，而霍乱毒素(CT)和大肠杆菌热敏毒素(LT)是目前研究最为深入的黏膜免疫佐剂，可促进抗原呈递细胞的抗原呈递，刺激Th2型黏膜免疫，活化Th2细胞免疫途径，促进上皮细胞内淋巴细胞的有丝分裂和B细胞种型分化，克服了因抗原的免疫耐受而起免疫促进作用.虽然口服疫苗是一种较为理想的免疫接种途径，但实验表明，口服黏膜佐剂可产生不同程度的副作用，CT可诱生超敏反应以及LT的毒力所致腹泻等不耐受症状.经过不断的探索和研究，目前开发了更为安全而有效的黏膜免疫佐剂.
2.1 霍乱毒素(choleratoxin，CT) CT是一种强有力的免疫佐剂，其作用机制是通过抑制口服抗原的免疫耐受而发挥免疫促进作用，但由于毒性作用的存在-超敏反应等，使他的应用受到了一定的限制.研究发现，具有两个亚基A2、B的CT，通过生物学的改造后，具有毒副作用小的特点，因而得到了广泛的应用.CT-B具有增强免疫作用，目前认为CT-B是至今为止最有效最安全的黏膜免疫佐剂之一，多数研究学者将CT-B与Hp的重组抗原结合起来免疫小鼠，可使小鼠获得免疫力.
2.2 大肠杆菌热敏毒素(LT) 目前最受青昧的黏膜免疫佐剂是LT-B，因为LT-B比CT-B拥有更可靠的安全性和有效性.实验发现，与Hp的重组抗原结合，免疫小鼠几乎不出现副作用.Pizza et al [63]报道:CT和LT虽然是强的免疫佐剂，但在人体实验中发现，具有很大的副作用.目前，通过大量的实验研究，将LT的A亚单位第63位的赖氨酸被丝氨酸取代，开发出无毒副作用的LTK63，以及第72位的精氨酸被丙氨酸取代保留了部分酶活性LTR72，二者都具有黏膜免疫佐剂的作用，与有效的抗原一起，刺激机体产生强的免疫力.
3 Hp侯选疫苗释放系统的选择某些载体(细菌或质粒)，经过分子生物学改造以后，具有无比的优越性-独特的安全性和免疫佐剂的作用而受到科学家们的关注.
3.1 真核表达载体pcDNA3.1(+) 核酸疫苗(DNA疫苗)是1990年初发展起来的一种全新的第三代疫苗，因其不仅能诱导体液免疫及细胞免疫，而且还具有容易构建与改造，制备工艺简单等传统疫苗难以比拟的优点，而受到普遍重视.据文献报道，注入的DNA可以达到机体的其他部位，且能被多种细胞摄取DNA质粒，而进入细胞，这为DNA疫苗奠定了基础.pcDNA3.1(+)作为研究工具，将Hp侯选抗原基因克隆至pcDNA3.1(+)，探讨其在真核细胞表达的情况.实验结果表明，Hp侯选抗原能在真核细胞中表达，并能使接种的动物获得对Hp的免疫力.国内外已报道了HpUreB及HspA2B核酸疫苗的构建，初步证明了其免疫原性及免疫保护作用[55].
3.2 减毒的沙门菌 Koesling et al [64]采用重组的尿素酶A、B的减毒沙门菌(SL3261[pYZ97])单剂量口服免疫BALB/c、C57BL/6小鼠，能够产生持久的免疫力，攻击实验表明，重组减毒沙门菌疫苗既能够预防Hp感染，而且能够治疗Hp的感染.Bumann et al [65]研究发现，尿素酶能够在重组减毒沙门菌Ty21a(pDB1)中表达，同时对9位志愿者和3位志愿者分别接种了Ty21a(pDB1)和Ty21a，结果发现:没有严重的副作用发生，12位志愿者中有10位针对沙门菌产生了体液免疫反应，3位产生了针对尿素酶的T细胞的免疫反应，因此作者认为重组减毒沙门菌疫苗是以T细胞介导的保护性的免疫反应.Liao et al [66]探索了表达Hp过氧化氢酶的减毒沙门菌疫苗(SL3261)的作用，通过口服，将其免疫C57BL/6小鼠，随后给予Hp悉尼菌株攻击，结果发现:该疫苗能诱导有效地免疫反应，预防和治疗Hp的感染.通过以上实验说明，减毒沙门菌不仅是一种有效的免疫载体，而且能刺激细胞免疫和诱导体液免疫.
3.3 乳酸杆菌 研究表明，乳酸杆菌是肠道的正常菌群，同时可以作为一种载体表达菌，他能够表达Hp的各种成分.Leeet al [67]报道，通过将Hp尿素酶基因克隆至载体pTREX1，转染乳酸杆菌，而后表达尿素酶，构建了乳酸杆菌MG1363疫苗，可溶性表达尿素酶，占菌体总量的6.25%，以不同剂量、方案口服免疫C57BL/6，结果发现:乳酸杆菌MG1363疫苗能够诱导体液免疫而起保护作用.
3.4 卡介苗(BCG) 以往主要用于预防结核菌的感染，由于是活载体及其独特的安全性和免疫佐剂作用而近来受到科学家们的关注，经过分子生物学改造以后，已构建出能在BCG中表达外源基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒.现研究表明:重组BCG(rBCG)能够表达IL-12、IFN-g、GM-CSF、HCG-b，且能被机体识别，可用于人类的生物治疗.重组BCG技术已经作为一种分子生物学技术广泛用于疫苗、肿瘤、治疗等领域[68-79].具有其他疫苗载体不可比拟的优越性，即毒副作用小、安全、生产工艺简单，不需要纯化，成本低，本身就是很强的免疫佐剂，一次性接种，终身带菌，可使机体产生长期的细胞免疫和体液免疫，因而该疫苗是一种理想、高效、特异的疫苗，他将预防和治疗于一体.如果外源基因在BCG中过度表达，还可以通过体外干预的方法终止其过度表达.目前我们正在构建重组BCG-Hp/OMP，以期待获得一种理想的疫苗.
4 Hp疫苗的免疫保护机制目前Hp疫苗诱导机体产生保护性免疫和治疗作用的机制仍不清楚.Saldinger et al [46]采用rUreB结合霍乱毒素(CT)免疫BALB/c小鼠，研究发现，脾脏CD4+T细胞增生，血清中lgG1增加，同时伴随IL-4的增高，g-干扰素的减少，从而推测rUreB可能诱导了Th2CD4+T细胞增生，有助于Hp的根除.Ghiara et al [50]认为Hp疫苗可能改变了胃内Th1型应答反应，通过Th2或Th0型起保护性反应，而Th1型应答反应产生IFN-g、IL-12等细胞因子引起黏膜的损害，而Th2或Th0免疫应答则引起体液免疫反应，产生S-IgA以及IL-4、IL-10等细胞因子而起免疫保护作用，也有研究表明[80]，Th1型免疫反应同时也参与了免疫保护机制，Th1和Th2的平衡协调可能对疫苗的保护机制更为重要.Blanchard et al [81]报道，通过对人和动物长期的研究发现，Hp引起内在免疫反应的能力受到宿主基因框架的调节，也就是说，机体的免疫状态对Hp根除或者加重Hp所致的胃肠道疾病起了决定性的作用.
5 Hp疫苗的未来Hp疫苗的研究虽然取得了显著的进展，预计将有商品化的Hp疫苗进入临床实验，但是Hp疫苗成功地应用于人类预防和临床治疗尚有许多困难有待解决;尚有许多工作有待深入:(1)进一步需要阐明人体感染Hp后地免疫应答和疫苗免疫保护机制，为疫苗的设计及免疫策略提供依据;(2)进一步筛选更为有效的抗原制备疫苗和研制更完善的核酸疫苗;(3)研制更安全有效的疫苗运载释放系统及有效的免疫接种途径;(4)建立更能客观评价疫苗免疫效果的动物模型等.Hp疫苗的研制已成为全球研究的热点，美国已将其列为21世纪疫苗优先发展的II类项目，有人预测在2010年代，Hp疫苗将有选择地应用于人群的预防和临床治疗.
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