DNA聚合酶a反义寡聚脱氧核苷酸抑制人胃癌细胞生长的研究
1中国人民解放军第一军医大学第二附属医院肝胆外科 广东省广州市 510282
2原第一军医大学珠江医院肝胆外科硕士生，现在广州军区总医院普外科
项目负责人 高毅中国人民解放军第一军医大学第二附属医院肝胆外科 广东省广州市 510282
收稿日期 1999-09-22
Subject headings stomach neoplasms; DNA polymerase-a; antisense oligodeoxy nucleotide
, http://www.100md.com
主题词 胃肿瘤；DNA聚合酶a；反义寡聚脱氧核苷酸
肿瘤的特异性治疗一直是医学上的难题，常规的化疗药物对肿瘤的治疗效果不满意，而且副反应明显. 近年来，应用人工合成的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)与靶基因或mRNA特异性互补结合，通过抑制与肿瘤发生及发展密切相关的基因产物的表达而达到特异性治疗目的[1，2]. 我们设计并合成了互补于DNA聚合酶a(DNA polymerase-a，DNApol-a)的ASODN，作用于人胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803，并用正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作对照，观察其特异性抑制癌细胞生长的效应.
1 材料和方法
1.1 材料 SGC-7901和MGC-803人胃癌细胞系由第四军医大学西京医院消化中心提供，在含100mL/L灭活小牛血清(广州农工商联合公司)的RPMI 1640(Gibco BRL)培养液，37℃，50mL/L CO2条件下培养. HUVEC原代及继代培养按何红兵等报道的方法[3，4]，取第3，4代作正常对照.
, 百拇医药
1.2 方法 寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides ODNs)互补于pol-a mRNA翻译起始区的ASODN(L1)及SODN(L2)和互补于开放读框功能Ⅰ区的ASODN(L3)癝ODN(L4)均由上海复旦大学遗传所合成. 2个胃癌细胞系及HUVEC各设1组，每组分L1～L4四个实验组和一个空白对照组. 制备细胞悬液，按0.5×104个/孔接种于96孔板上，培养24h后换液，重新加入培养液及60，80，100，120mg/L的ODNs，每隔24h重复加入20mg/L(不换液)，每个浓度设了3个复孔，分别在24，48，72，96h后获取细胞进行血计数板计数，每次实验取3个复孔的均值，重复3次，结果表示为x±s用t检验比较样本均数. FCM测定在暨南大学组织移植与免疫实验室协助下完成. 收获100mg/L ODNs处理48h后的各组细胞至少1×109个，700mL/L酒精固定，用PBS洗涤2次，10g/L碘化丙碇(Sigma)DNA染色30min，用FCM为美国BD公司出产的FAC-Star plas每组测1×109个细胞，CV值稳定在<4%，最终获得各组细胞周期时相比率，用u检验比较二样本率.
, 百拇医药
2 结果
2.1 胃癌细胞系SGC-7901的生长 互补于pol-a mRNA翻译起始区的ASODN(L1)明显抑制了胃癌细胞的生长，抑制效果随浓度增加而增强，50%抑制浓度约为100mg/L. 其余的ODNs无明显效应. MGC-803人胃癌细胞系的情况与此类似，而HUVEC对所有ODNs都不敏感.
2.2 胃癌细胞系的细胞量互补 于pol-a翻译起始区的ASODN(L1)在与SGC-7901培养48h后明显抑制了癌细胞的生长，但96h后细胞停止增殖，余ODNs均无显著效应(表2). MGC-803的情况与此类似，而HUVEC在培养96h内对所有ODNs均不敏感.
2.3 胃癌细胞系SGC-7901的细胞周期互补于pol-a mRNA翻译 起始区ASODN(L1)处理组癌细胞G0/1期比率增高，而S期及G2M期比率下降(表3). MGC-803的结果与此相同.
, 百拇医药
表1 人胃癌细胞SGC-7901与ODNs培养48h后的细胞数(×109/孔)
, 百拇医药
aP<0.05，vs 对照组.
表2 人胃癌细胞SGC-7901与100mg/L的ODNs培养不同时间后的细胞数(×109/孔)
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组.
表3 人胃癌细胞SGC-7901与100mg/L的ODNs培养48h后细胞周期各时相比率
, 百拇医药
aP<0.05, vs 对照组.
3 讨论
DNA pol-a是真核细胞中DNA成分的关键酶，与肿瘤的发生和发展密切相关. 我们用分子杂交技术在国内外首次对胃癌细胞内的DNA pol-a的表达情况作系统研究，结果发现外科切除的人胃癌组织内DNA pol-a活性及mRNA表达a均明显高于癌旁组织和正常组织，并提出了DNA pol-a作为肿瘤新标志物的可能性[5，6]. 在此基础上，我们设计并合成了互补于pol-a mRNA的ASODN作用于人胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803，结果发现互补于翻译起始区的ASODN(L1)可特异地抑制人胃癌细胞生长，而对正常HUVEC无显著效应. 关于ASODN的研究目前主要在体外细胞培养系统中进行[7]. 我们的实验结果因为使用了人肿瘤细胞系而可能被放大，但仍为ASODN的进一步实验研究和临床应用提供了基础.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Yokozaki H, Budillon A, Tortora S, Meissner S, Beaacage SL, Miki K, Cho-Chung YS. An antisense oligodeoxynucleotide that depletes
RI alpha subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase induces growth inhibition in human cancer cells. Cancer Res,1993;53:868-872
2 Watson JM, Bevek JS, Martinez MO. Growth inhibition of ovarian cancer cells induced by antisense IL-6 oligonucleotides.
, http://www.100md.com
Gynecol Oncol, 1993;49:8-15
3 何红兵. 人脐静脉内皮细胞的长期传代培养. 第一军医大学学报，1990；10：312-316
4 何红兵，潘玉先. 人脐静脉内皮细胞体外培养20天左右是进行有关研究的较佳时期. 中国病理生理学杂志，1992；8：477-478
5 高毅，张晓华，华积德，谢毅，王启松. 人胃癌组织DNA聚合酶a mRNA表达. 第一军医大学学报，1994；14：182-185
6 高毅，华积德，杨继震，闻兆章，路德元，陈金国. 血清DNA聚合酶活性对胃癌诊断价值. 第一军医大学学报，1994；14：28-30
7 Citro G, Perrotti D, Cucco CD, Agnano I, Sacchi A, Iupi G, Calabretta B. Inhibition of leukemia cell proliferation by receptor-
mediated uptake of c-myb antisense oligodeoxynucleotides. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:7031-7035, http://www.100md.com(俞金龙1 高 毅1 程黎阳2)
2原第一军医大学珠江医院肝胆外科硕士生，现在广州军区总医院普外科
项目负责人 高毅中国人民解放军第一军医大学第二附属医院肝胆外科 广东省广州市 510282
收稿日期 1999-09-22
Subject headings stomach neoplasms; DNA polymerase-a; antisense oligodeoxy nucleotide
, http://www.100md.com
主题词 胃肿瘤；DNA聚合酶a；反义寡聚脱氧核苷酸
肿瘤的特异性治疗一直是医学上的难题，常规的化疗药物对肿瘤的治疗效果不满意，而且副反应明显. 近年来，应用人工合成的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)与靶基因或mRNA特异性互补结合，通过抑制与肿瘤发生及发展密切相关的基因产物的表达而达到特异性治疗目的[1，2]. 我们设计并合成了互补于DNA聚合酶a(DNA polymerase-a，DNApol-a)的ASODN，作用于人胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803，并用正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作对照，观察其特异性抑制癌细胞生长的效应.
1 材料和方法
1.1 材料 SGC-7901和MGC-803人胃癌细胞系由第四军医大学西京医院消化中心提供，在含100mL/L灭活小牛血清(广州农工商联合公司)的RPMI 1640(Gibco BRL)培养液，37℃，50mL/L CO2条件下培养. HUVEC原代及继代培养按何红兵等报道的方法[3，4]，取第3，4代作正常对照.
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1.2 方法 寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides ODNs)互补于pol-a mRNA翻译起始区的ASODN(L1)及SODN(L2)和互补于开放读框功能Ⅰ区的ASODN(L3)癝ODN(L4)均由上海复旦大学遗传所合成. 2个胃癌细胞系及HUVEC各设1组，每组分L1～L4四个实验组和一个空白对照组. 制备细胞悬液，按0.5×104个/孔接种于96孔板上，培养24h后换液，重新加入培养液及60，80，100，120mg/L的ODNs，每隔24h重复加入20mg/L(不换液)，每个浓度设了3个复孔，分别在24，48，72，96h后获取细胞进行血计数板计数，每次实验取3个复孔的均值，重复3次，结果表示为x±s用t检验比较样本均数. FCM测定在暨南大学组织移植与免疫实验室协助下完成. 收获100mg/L ODNs处理48h后的各组细胞至少1×109个，700mL/L酒精固定，用PBS洗涤2次，10g/L碘化丙碇(Sigma)DNA染色30min，用FCM为美国BD公司出产的FAC-Star plas每组测1×109个细胞，CV值稳定在<4%，最终获得各组细胞周期时相比率，用u检验比较二样本率.
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2 结果
2.1 胃癌细胞系SGC-7901的生长 互补于pol-a mRNA翻译起始区的ASODN(L1)明显抑制了胃癌细胞的生长，抑制效果随浓度增加而增强，50%抑制浓度约为100mg/L. 其余的ODNs无明显效应. MGC-803人胃癌细胞系的情况与此类似，而HUVEC对所有ODNs都不敏感.
2.2 胃癌细胞系的细胞量互补 于pol-a翻译起始区的ASODN(L1)在与SGC-7901培养48h后明显抑制了癌细胞的生长，但96h后细胞停止增殖，余ODNs均无显著效应(表2). MGC-803的情况与此类似，而HUVEC在培养96h内对所有ODNs均不敏感.
2.3 胃癌细胞系SGC-7901的细胞周期互补于pol-a mRNA翻译 起始区ASODN(L1)处理组癌细胞G0/1期比率增高，而S期及G2M期比率下降(表3). MGC-803的结果与此相同.
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表1 人胃癌细胞SGC-7901与ODNs培养48h后的细胞数(×109/孔)
| 分组 | ρ(ODNs)/(mg·L-1) | ||||
| 60 | 80 | 100 | 120 | 对照 | |
| L1 | 1.21±0.14 | 1.16±0.08 | 0.62±0.03a | 0.53±0.02a | 1.26±0.11 |
| L2 | 1.33±0.23 | 1.26±0.17 | 1.18±0.11 | 1.09±0.13 | 1.37±0.14 |
| L3 | 1.38±0.21 | 1.31±0.15 | 1.25±0.12 | 1.23±0.17 | 1.41±0.11 |
| L4 | 1.41±0.22 | 1.37±0.15 | 1.32±0.14 | 1.28±0.11 | 1.47±0.15 |
, 百拇医药
aP<0.05，vs 对照组.
表2 人胃癌细胞SGC-7901与100mg/L的ODNs培养不同时间后的细胞数(×109/孔)
| 分组 | t/h | |||
| 24 | 48 | 72 | 96 | |
| L1 | 0.56±0.07 | 0.71±0.05a | 1.01±0.08b | 1.16±0.11a |
| L2 | 0.68±0.05 | 1.51±0.12 | 2.78±0.31 | 4.11±0.11 |
| L3 | 0.83±0.13 | 1.76±0.13 | 2.87±0.16 | 3.71±0.15 |
| L4 | 0.81±0.11 | 1.81±0.21 | 3.08±0.23 | 3.89±0.19 |
| 对照 | 0.79±0.11 | 1.63±0.16 | 3.14±0.21 | 4.21±0.19 |
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aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组.
表3 人胃癌细胞SGC-7901与100mg/L的ODNs培养48h后细胞周期各时相比率
| 分组 | 细胞周期时相/% | ||
| G0/1 | S | G2M | |
| L1 | 45.1 | 22.2 | 32.6 |
| L2 | 79.6a | 9.7 | 10.7a |
| L3 | 54.5 | 16.4 | 29.1 |
| L4 | 50.0 | 18.4 | 31.8 |
| 对照 | 42.8 | 19.1 | 33.6 |
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aP<0.05, vs 对照组.
3 讨论
DNA pol-a是真核细胞中DNA成分的关键酶，与肿瘤的发生和发展密切相关. 我们用分子杂交技术在国内外首次对胃癌细胞内的DNA pol-a的表达情况作系统研究，结果发现外科切除的人胃癌组织内DNA pol-a活性及mRNA表达a均明显高于癌旁组织和正常组织，并提出了DNA pol-a作为肿瘤新标志物的可能性[5，6]. 在此基础上，我们设计并合成了互补于pol-a mRNA的ASODN作用于人胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803，结果发现互补于翻译起始区的ASODN(L1)可特异地抑制人胃癌细胞生长，而对正常HUVEC无显著效应. 关于ASODN的研究目前主要在体外细胞培养系统中进行[7]. 我们的实验结果因为使用了人肿瘤细胞系而可能被放大，但仍为ASODN的进一步实验研究和临床应用提供了基础.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Yokozaki H, Budillon A, Tortora S, Meissner S, Beaacage SL, Miki K, Cho-Chung YS. An antisense oligodeoxynucleotide that depletes
RI alpha subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase induces growth inhibition in human cancer cells. Cancer Res,1993;53:868-872
2 Watson JM, Bevek JS, Martinez MO. Growth inhibition of ovarian cancer cells induced by antisense IL-6 oligonucleotides.
, http://www.100md.com
Gynecol Oncol, 1993;49:8-15
3 何红兵. 人脐静脉内皮细胞的长期传代培养. 第一军医大学学报，1990；10：312-316
4 何红兵，潘玉先. 人脐静脉内皮细胞体外培养20天左右是进行有关研究的较佳时期. 中国病理生理学杂志，1992；8：477-478
5 高毅，张晓华，华积德，谢毅，王启松. 人胃癌组织DNA聚合酶a mRNA表达. 第一军医大学学报，1994；14：182-185
6 高毅，华积德，杨继震，闻兆章，路德元，陈金国. 血清DNA聚合酶活性对胃癌诊断价值. 第一军医大学学报，1994；14：28-30
7 Citro G, Perrotti D, Cucco CD, Agnano I, Sacchi A, Iupi G, Calabretta B. Inhibition of leukemia cell proliferation by receptor-
mediated uptake of c-myb antisense oligodeoxynucleotides. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:7031-7035, http://www.100md.com(俞金龙1 高 毅1 程黎阳2)