磺化多糖抑制人免疫缺陷病毒的研究进展
来自中国生化药物杂志 作者：方波 张莲萍
摘 要 综述了近10年来磺化多糖抑制人免疫缺陷病毒的研究进展，讨论了其抑制病毒活性的机理。
中图分类号 R979.5
Study Advances in Sulfated Polysaccharide with Anti-human Immuno-deficiency Virus Activities
Fang Bo, Zhang Lianping
(East China University of Science and Technology，Shanghai 200237)
1 引 言
, 百拇医药
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是人类获得性免疫缺陷综合征(即艾滋病，AIDS)及其相关并发症的病原体。HIV是一种罕见的人类逆转录病毒。由于该病毒可感染人体免疫细胞并摧毁免疫系统，使人丧失对疾病的抵抗力，因而成为迄今为止出现的危害最大的疾病。
自1981年报道首例AIDS以来，人们已在发病原因、发病过程及治疗药物方面做了大量探索。基本认清了HIV的基本结构和感染细胞并复制自身的主要环节，并在此基础上研制HIV-1抑制剂。现已出现的HIV-1抑制剂包括：病毒逆转录酶活性抑制剂、蛋白酶抑制剂[1]和磺化多糖[2～11]。前者通过抑制HIV的RNA转变成DNA达到抑制病毒活性的目的。该类药物主要是核苷类衍生物(如二脱氧叠氮胸苷AZT等)，对改善AIDS患者的生活质量及延长寿命具有较好作用，但毒副作用大，且易出现耐药性。蛋白酶抑制剂则是通过抑制病毒逆转录酶的形成及病毒成熟过程，达到抑制病毒活性的目的，但也会产生较强副作用和耐药性。磺化多糖是指含有磺酸基团的天然及半合成的酸性多糖，为聚阴离子，常具有类肝素特性(如调脂、抗凝、改善血液流变特性等)。自1987年发现磺化葡聚糖具有抑制HIV活性以来[2]，对此类多糖的研究十分活跃[3～10]。经过10多年的研究，已开发出多种天然多糖的磺化衍生物，并对其构效关系进行了初步探讨，本文就此方面的研究进展进行综述。
, 百拇医药
2 磺化多糖抑制HIV的研究进展
2.1 具有抑制HIV活性的磺化多糖
研究表明，磺化多糖(如磺化葡聚糖、肝素)可在体外抑制
HIV-1对CD4阳性细胞的感染，其完全抑制HIV活性的浓度在10 μg/ml的数量级上[2～4]。戊聚糖磺酸盐、蘑菇多糖磺酸盐、卡拉胶、甘草甜素、甘露聚糖磺酸盐、呋喃木糖和呋喃核糖的磺化衍生物、氨基多糖磺酸盐等也具有抗HIV活性，且无显著细胞毒性[5～9]。
以β-(1→3)糖苷键连接的多糖磺酸盐如curdlan sulfate，在体外完全抑制HIV活性的浓度为3.3 μg/ml，亦无显著细胞毒性[10]，该物质还具有很低的抗凝活性。临床研究表明，每人注射高达200 mg时，未发现抗凝效应，同时注射该药物后，人体血液中的CD4细胞明显增多。另外，最近的研究还指出，低聚糖磺酸盐也具有很高的抗HIV活性[11]。这些研究为进一步研制新型多糖类HIV-1抑制剂奠定了基础。
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2.2 影响磺化多糖抑制HIV活性的因素
天然多糖种类繁多，其磺化衍生物抑制HIV的活性有所差别。影响其抑制HIV活性的因素主要包括天然多糖的骨架结构、取代度(特别是硫含量)、取代基的种类和取代位置、分子量大小、是否含有支链以及支链的种类等。
磺化多糖结构不同，其抑制效果不同。肝素是典型的酸性粘多糖。Christopher等[3]研究了经不同化学修饰后肝素抗HIV的活性。结果表明，选择性脱除肝素结构中的磺酸基团，将显著降低其抗HIV的活性。例如未修饰肝素防止50%细胞受HIV感染的有效剂量(ED50)为20 μg/ml，N-脱硫肝素的ED50为100 μg/ml，而N，O-全脱硫肝素则失去全部活性，从而证实磺酸基团具有重要作用。另外，减少肝素结构中的羧酸基团，对降低抗HIV的活性影响较小。
Yoshida等[10]研究了不同硫含量和分子量的curdlan sulfate的抑制效果，结果表明，硫含量小于5.6%的磺化产物无抑制HIV活性，而硫含量为12.1%～14.7%的产物在浓度为3.3 μg/ml时即可抑制HIV活性。也证明磺酸基团数量对抑制效果影响显著。
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对具有不同支链呋喃核糖的磺化衍生物的抗HIV活性研究表明，以甘露糖为支链的呋喃核糖的磺酸盐(硫含量为16.1%，分子量为1.2×104)，其ED50为3.3 μg/ml；而以葡萄糖为支链的呋喃核糖的磺酸盐(硫含量为16.8%，分子量为1.1×104)，其ED50为0.27 μg/ml；说明支链的种类对抑制效果也有不同[8]。
磺化壳聚糖衍生物也具有良好的抑制HIV活性，如磺化壳聚糖、N-羧甲基-N，O-磺化壳聚糖等。其抑制活性与磺化基团的取代位置、硫含量及分子量密切相关。若将壳聚糖C2位上的氨基和C3位上的羟基同时磺化，可得到2-磺胺基-3-O-磺化壳聚糖(记为23 S)；若只将壳聚糖C6位上的羟基磺化，则得到6-O-磺化壳聚糖(记为6 S)；若将甲壳素C3位上的羟基磺化，可得到3-O-磺化甲壳素(记为3 S)。Nishimura等[7]考察了它们的活性，结果表明，对6 S(硫含量为10.2%，分子量为5.8×104)，其ED50为57.0 μg/ml；对3 S(硫含量为5.4%，分子量为2.8×104)，其ED50为9.6 μg/ml；而对23 S(硫含量为16.5%，分子量为1.6×104)，其ED50为0.28 μg/ml，从而说明取代基位置、硫含量及分子量对磺化壳聚糖的抑制HIV活性影响显著。
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2.3 磺化多糖抑制HIV活性的机理
研究表明，HIV感染细胞并复制自身的第一步为：HIV-1吸附于细胞表面(主要是CD4阳性T淋巴细胞)并进入细胞。在此阶段，HIV-1外膜蛋白gp 120与CD4相互作用而吸附于细胞上；HIV通过与免疫细胞上的受体相结合进入细胞，并释放出单股病毒RNA。该环节是HIV侵害免疫细胞的关键步骤。若能有效阻止HIV进入细胞，则HIV的感染力将大大下降。一般认为，磺化多糖可通过阻止HIV外膜蛋白gp 120与CD4阳性细胞相互结合、融合，阻止HIV进入细胞，达到抑制病毒活性的目的。但不同多糖磺化衍生物可能有不同的抑制机理[3，4]。
磺化葡聚糖可结合重组CD4，并阻断病毒重组gp 120与细胞受体CD4的结合。而肝素基本无此活性。因此，虽然这两种多糖均表现抗HIV活性，但其作用方式不同。
磺化多糖显示抗HIV活性的另一个作用点是gp 120上的第三变异环(V3 Loop)。V3环被认为是细胞感染步骤中的重要一环。在gp 120与细胞受体CD4结合后，V3环是病毒融入细胞所必须的物质。V3环在gp 120的氨基酸序列中，碱性氨基酸的密度很高。Callahan等及Christopher等指出，肝素可选择抑制V3环的特异单克隆抗体(Mabs)与gp 120的结合，尽管肝素不能阻断重组gp 120与重组CD4的相互结合环节[3，4]。
, 百拇医药
磺化多糖为聚阴离子，可与HIV病毒外膜蛋白上或CD4的某些敏感结构域发生相互作用，掩蔽了活性区域，从而抑制HIV对细胞的吸附或融合，使之不能进入细胞进行复制。抑制病毒原理主要基于阻断HIV-1结合细胞环节，抑制HIV感染免疫细胞，从而抑制病毒大量繁殖[2，5]。
另外，磺化多糖显示抗HIV活性还可通过以下机理[6]：1)竞争性抑制HIV病毒逆转录酶活性，但所需剂量比阻断病毒结合靶细胞要高；2)抑制逆转录病毒核糖核酸酶 H，肝素、磺化葡聚糖和木聚糖磺酸盐均显示出这种活性；3)可抑制HIV诱发的细胞融合(即合体细胞的形成)，磺化葡聚糖和戊聚糖磺酸盐显示出这种活性。目前，关于磺化多糖抑制HIV活性的机理仍在深入研究中。
3 结 语
21世纪是生命科学的世纪。AIDS对人类危害性极大，研制高效、低毒、价廉的HIV抑制剂，应是今后的发展趋势。国内研究着重在对HIV分离、表征、基因分析等方面[12]，而对抑制HIV药物的研究报道甚少[13]。国内对磺化多糖的研制已取得良好进展，但对其抑制HIV活性的研究是亟待加强和赶超的领域。进一步加强对新型磺化多糖的研制及其抑制HIV活性的研究，将对控制AIDS作出积极贡献。
, 百拇医药
参考文献
1，李以欣.用于人免疫缺陷病毒及相关感染的新药.国外医药——合成药.生化药制剂分册，1998，19(4)∶224～225
2，Ueno R, Kuno S.Dextran sulfate,a potent anti-HIV agent in vitro having synergism with zidovudine.Lancet,1987,1∶1379
3，Christopher CR,Deirdre RC,Hilary AH,et al.Anti-HIV-1 activity of chemically modified heparins:correlation between binding to the V3 loop of gp120 and inhibition of cellular HIV-1 infection in vitro.Biochemistry 1994,33∶6974～6980
, http://www.100md.com
4，Baba M,Pauwels R,Balzarini J,et al.Mechanism of inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on replication of human immunodeficiency virus in vitro. Proc Natl Acad Sci USA,1988,85∶6132～6136
5，Hattori K,Yoshida T,Nakashima H,et al. Synthesis of sulfonated amino-polysaccharides having anti-HIV and blood anticoagulant activities. Carbohydr Res, 1998,312∶1～8
6，Gama Sosa MA,Fazely F,Koch JA,at el. N-carboxymethyl chitosan-N,O-sulfate as an anti-HIV-1 agent.Biochem Biophy Res Commun,1991,174(2)∶489～496
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7，Nishimura SI,Kai H,Shinada K,et al. Regioselective syntheses of sulfated polysacharides:speecific anti-HIV-1 activity of novel chitin sulfates.Carbohydr Res,1998,306∶427～433
8，Yoshida T,Katayama Y,Inoue S,et al.Synthesis of branched ribofuranans and their sulfates with strong anti-AIDS virus activity by selective ring-opening copolymerization of 1,4-anhydro-α-D-ribopyranose derivatives.Macromolecules,1992,25∶4051～4057
9，Yoshida O,Nakashima HM,Yoshida T,et al. Sulfation of the immunomodulating polysaccharide lentinan:a novel stratecy for antivirals to human immunodeficiency virus (HIV).Biochem Pharmacol,1988,37(15)∶2887～2981
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10，Yoshida T,Hatanaka K,Uryn T,et al.Synthesis and structural analysis of curdlan sulfate with a potent inhibitory effect in vitro of AIDS virus infection.Macromolecules,1990,23∶3712～3722
11，Katsuraya K,Nakashima H,Yamamoto N,et al.Synthesis of sulfated oligosaccharide glycosides having high anti-HIV activity and the relationship between activity and chemical structure.Carbohydr Res,1999,315∶234～242
12，王斌，鲁晓晴，邵一鸣，等.人类免疫缺陷病毒1型云南株外膜蛋白原核表达克隆的构建.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(1)∶29～32
13，康来仪，潘孝彰，翁心华.艾滋病防治手册.上海∶上海医科大学出版社，1999∶222, 百拇医药
摘 要 综述了近10年来磺化多糖抑制人免疫缺陷病毒的研究进展，讨论了其抑制病毒活性的机理。
中图分类号 R979.5
Study Advances in Sulfated Polysaccharide with Anti-human Immuno-deficiency Virus Activities
Fang Bo, Zhang Lianping
(East China University of Science and Technology，Shanghai 200237)
1 引 言
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人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是人类获得性免疫缺陷综合征(即艾滋病，AIDS)及其相关并发症的病原体。HIV是一种罕见的人类逆转录病毒。由于该病毒可感染人体免疫细胞并摧毁免疫系统，使人丧失对疾病的抵抗力，因而成为迄今为止出现的危害最大的疾病。
自1981年报道首例AIDS以来，人们已在发病原因、发病过程及治疗药物方面做了大量探索。基本认清了HIV的基本结构和感染细胞并复制自身的主要环节，并在此基础上研制HIV-1抑制剂。现已出现的HIV-1抑制剂包括：病毒逆转录酶活性抑制剂、蛋白酶抑制剂[1]和磺化多糖[2～11]。前者通过抑制HIV的RNA转变成DNA达到抑制病毒活性的目的。该类药物主要是核苷类衍生物(如二脱氧叠氮胸苷AZT等)，对改善AIDS患者的生活质量及延长寿命具有较好作用，但毒副作用大，且易出现耐药性。蛋白酶抑制剂则是通过抑制病毒逆转录酶的形成及病毒成熟过程，达到抑制病毒活性的目的，但也会产生较强副作用和耐药性。磺化多糖是指含有磺酸基团的天然及半合成的酸性多糖，为聚阴离子，常具有类肝素特性(如调脂、抗凝、改善血液流变特性等)。自1987年发现磺化葡聚糖具有抑制HIV活性以来[2]，对此类多糖的研究十分活跃[3～10]。经过10多年的研究，已开发出多种天然多糖的磺化衍生物，并对其构效关系进行了初步探讨，本文就此方面的研究进展进行综述。
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2 磺化多糖抑制HIV的研究进展
2.1 具有抑制HIV活性的磺化多糖
研究表明，磺化多糖(如磺化葡聚糖、肝素)可在体外抑制
HIV-1对CD4阳性细胞的感染，其完全抑制HIV活性的浓度在10 μg/ml的数量级上[2～4]。戊聚糖磺酸盐、蘑菇多糖磺酸盐、卡拉胶、甘草甜素、甘露聚糖磺酸盐、呋喃木糖和呋喃核糖的磺化衍生物、氨基多糖磺酸盐等也具有抗HIV活性，且无显著细胞毒性[5～9]。
以β-(1→3)糖苷键连接的多糖磺酸盐如curdlan sulfate，在体外完全抑制HIV活性的浓度为3.3 μg/ml，亦无显著细胞毒性[10]，该物质还具有很低的抗凝活性。临床研究表明，每人注射高达200 mg时，未发现抗凝效应，同时注射该药物后，人体血液中的CD4细胞明显增多。另外，最近的研究还指出，低聚糖磺酸盐也具有很高的抗HIV活性[11]。这些研究为进一步研制新型多糖类HIV-1抑制剂奠定了基础。
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2.2 影响磺化多糖抑制HIV活性的因素
天然多糖种类繁多，其磺化衍生物抑制HIV的活性有所差别。影响其抑制HIV活性的因素主要包括天然多糖的骨架结构、取代度(特别是硫含量)、取代基的种类和取代位置、分子量大小、是否含有支链以及支链的种类等。
磺化多糖结构不同，其抑制效果不同。肝素是典型的酸性粘多糖。Christopher等[3]研究了经不同化学修饰后肝素抗HIV的活性。结果表明，选择性脱除肝素结构中的磺酸基团，将显著降低其抗HIV的活性。例如未修饰肝素防止50%细胞受HIV感染的有效剂量(ED50)为20 μg/ml，N-脱硫肝素的ED50为100 μg/ml，而N，O-全脱硫肝素则失去全部活性，从而证实磺酸基团具有重要作用。另外，减少肝素结构中的羧酸基团，对降低抗HIV的活性影响较小。
Yoshida等[10]研究了不同硫含量和分子量的curdlan sulfate的抑制效果，结果表明，硫含量小于5.6%的磺化产物无抑制HIV活性，而硫含量为12.1%～14.7%的产物在浓度为3.3 μg/ml时即可抑制HIV活性。也证明磺酸基团数量对抑制效果影响显著。
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对具有不同支链呋喃核糖的磺化衍生物的抗HIV活性研究表明，以甘露糖为支链的呋喃核糖的磺酸盐(硫含量为16.1%，分子量为1.2×104)，其ED50为3.3 μg/ml；而以葡萄糖为支链的呋喃核糖的磺酸盐(硫含量为16.8%，分子量为1.1×104)，其ED50为0.27 μg/ml；说明支链的种类对抑制效果也有不同[8]。
磺化壳聚糖衍生物也具有良好的抑制HIV活性，如磺化壳聚糖、N-羧甲基-N，O-磺化壳聚糖等。其抑制活性与磺化基团的取代位置、硫含量及分子量密切相关。若将壳聚糖C2位上的氨基和C3位上的羟基同时磺化，可得到2-磺胺基-3-O-磺化壳聚糖(记为23 S)；若只将壳聚糖C6位上的羟基磺化，则得到6-O-磺化壳聚糖(记为6 S)；若将甲壳素C3位上的羟基磺化，可得到3-O-磺化甲壳素(记为3 S)。Nishimura等[7]考察了它们的活性，结果表明，对6 S(硫含量为10.2%，分子量为5.8×104)，其ED50为57.0 μg/ml；对3 S(硫含量为5.4%，分子量为2.8×104)，其ED50为9.6 μg/ml；而对23 S(硫含量为16.5%，分子量为1.6×104)，其ED50为0.28 μg/ml，从而说明取代基位置、硫含量及分子量对磺化壳聚糖的抑制HIV活性影响显著。
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2.3 磺化多糖抑制HIV活性的机理
研究表明，HIV感染细胞并复制自身的第一步为：HIV-1吸附于细胞表面(主要是CD4阳性T淋巴细胞)并进入细胞。在此阶段，HIV-1外膜蛋白gp 120与CD4相互作用而吸附于细胞上；HIV通过与免疫细胞上的受体相结合进入细胞，并释放出单股病毒RNA。该环节是HIV侵害免疫细胞的关键步骤。若能有效阻止HIV进入细胞，则HIV的感染力将大大下降。一般认为，磺化多糖可通过阻止HIV外膜蛋白gp 120与CD4阳性细胞相互结合、融合，阻止HIV进入细胞，达到抑制病毒活性的目的。但不同多糖磺化衍生物可能有不同的抑制机理[3，4]。
磺化葡聚糖可结合重组CD4，并阻断病毒重组gp 120与细胞受体CD4的结合。而肝素基本无此活性。因此，虽然这两种多糖均表现抗HIV活性，但其作用方式不同。
磺化多糖显示抗HIV活性的另一个作用点是gp 120上的第三变异环(V3 Loop)。V3环被认为是细胞感染步骤中的重要一环。在gp 120与细胞受体CD4结合后，V3环是病毒融入细胞所必须的物质。V3环在gp 120的氨基酸序列中，碱性氨基酸的密度很高。Callahan等及Christopher等指出，肝素可选择抑制V3环的特异单克隆抗体(Mabs)与gp 120的结合，尽管肝素不能阻断重组gp 120与重组CD4的相互结合环节[3，4]。
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磺化多糖为聚阴离子，可与HIV病毒外膜蛋白上或CD4的某些敏感结构域发生相互作用，掩蔽了活性区域，从而抑制HIV对细胞的吸附或融合，使之不能进入细胞进行复制。抑制病毒原理主要基于阻断HIV-1结合细胞环节，抑制HIV感染免疫细胞，从而抑制病毒大量繁殖[2，5]。
另外，磺化多糖显示抗HIV活性还可通过以下机理[6]：1)竞争性抑制HIV病毒逆转录酶活性，但所需剂量比阻断病毒结合靶细胞要高；2)抑制逆转录病毒核糖核酸酶 H，肝素、磺化葡聚糖和木聚糖磺酸盐均显示出这种活性；3)可抑制HIV诱发的细胞融合(即合体细胞的形成)，磺化葡聚糖和戊聚糖磺酸盐显示出这种活性。目前，关于磺化多糖抑制HIV活性的机理仍在深入研究中。
3 结 语
21世纪是生命科学的世纪。AIDS对人类危害性极大，研制高效、低毒、价廉的HIV抑制剂，应是今后的发展趋势。国内研究着重在对HIV分离、表征、基因分析等方面[12]，而对抑制HIV药物的研究报道甚少[13]。国内对磺化多糖的研制已取得良好进展，但对其抑制HIV活性的研究是亟待加强和赶超的领域。进一步加强对新型磺化多糖的研制及其抑制HIV活性的研究，将对控制AIDS作出积极贡献。
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参考文献
1，李以欣.用于人免疫缺陷病毒及相关感染的新药.国外医药——合成药.生化药制剂分册，1998，19(4)∶224～225
2，Ueno R, Kuno S.Dextran sulfate,a potent anti-HIV agent in vitro having synergism with zidovudine.Lancet,1987,1∶1379
3，Christopher CR,Deirdre RC,Hilary AH,et al.Anti-HIV-1 activity of chemically modified heparins:correlation between binding to the V3 loop of gp120 and inhibition of cellular HIV-1 infection in vitro.Biochemistry 1994,33∶6974～6980
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4，Baba M,Pauwels R,Balzarini J,et al.Mechanism of inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on replication of human immunodeficiency virus in vitro. Proc Natl Acad Sci USA,1988,85∶6132～6136
5，Hattori K,Yoshida T,Nakashima H,et al. Synthesis of sulfonated amino-polysaccharides having anti-HIV and blood anticoagulant activities. Carbohydr Res, 1998,312∶1～8
6，Gama Sosa MA,Fazely F,Koch JA,at el. N-carboxymethyl chitosan-N,O-sulfate as an anti-HIV-1 agent.Biochem Biophy Res Commun,1991,174(2)∶489～496
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7，Nishimura SI,Kai H,Shinada K,et al. Regioselective syntheses of sulfated polysacharides:speecific anti-HIV-1 activity of novel chitin sulfates.Carbohydr Res,1998,306∶427～433
8，Yoshida T,Katayama Y,Inoue S,et al.Synthesis of branched ribofuranans and their sulfates with strong anti-AIDS virus activity by selective ring-opening copolymerization of 1,4-anhydro-α-D-ribopyranose derivatives.Macromolecules,1992,25∶4051～4057
9，Yoshida O,Nakashima HM,Yoshida T,et al. Sulfation of the immunomodulating polysaccharide lentinan:a novel stratecy for antivirals to human immunodeficiency virus (HIV).Biochem Pharmacol,1988,37(15)∶2887～2981
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11，Katsuraya K,Nakashima H,Yamamoto N,et al.Synthesis of sulfated oligosaccharide glycosides having high anti-HIV activity and the relationship between activity and chemical structure.Carbohydr Res,1999,315∶234～242
12，王斌，鲁晓晴，邵一鸣，等.人类免疫缺陷病毒1型云南株外膜蛋白原核表达克隆的构建.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(1)∶29～32
13，康来仪，潘孝彰，翁心华.艾滋病防治手册.上海∶上海医科大学出版社，1999∶222, 百拇医药