NO参与“肾俞”穴针刺效应过程的神经形态学证据
作者：陈泽斌 王 敏 熊迎春 吴昌清 袁尚荣
单位：湖北中医学院解剖教研室(430061)
关键词：
湖北中医杂志99zk117 临床和实验研究显示，针刺“肾俞”穴具有影响机体下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能，影响肾的泌尿功能等多方面的效应，提示神经体液因素在这一效应中的重要作用[1，2]，而作为神经-内分泌系统关键中枢核团之一的下丘脑室旁核(Hypothalanic Paraventricular nucleus,PVN,下同)对针刺“肾俞”穴反应如何却未见报道。为此，本文采用组织化学方法，着重观察了手捻针刺激大鼠右“肾俞”穴对PVN NOS-NADPH阳性神经元(以下简称NOS)的影响，拟为信息物质NO参与“肾俞”穴针刺效应提供形态学依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料Wistar大鼠，15只，重量220-250克，雌雄不限。随机分成三组：手针组；对照组；空白组。每组5只。
1.2 方法
1.2.1 取穴、麻醉和穴位刺激：参照华兴邦的大鼠穴位图谱[3]，于第二腰椎棘突下右侧旁开7mm取右“肾俞”穴，直刺8mm。采用甲氧氟烷吸入加1%戊巴比妥钠腹腔注射的复合麻醉方式。手针组：麻醉+手针；对照组：只麻醉，不刺激；空白组；不麻醉，不刺激。手针采用手捻针刺激10分钟，留针20分钟，运针频率控制在4次/秒，捻针幅度360度左右，中等强度[4]。每次实验各组均取一只同时进行。
1.2.2 材料制备：从刺激开始计2小时，各动物在戊巴比妥钠深麻下，开胸作经左心窒4°C 4%多聚甲醛(PB配制，PH7.4)灌注固定，灌毕即取脑，4°C后固定过夜，入含30%蔗糖的PB内4°C沉底，恒冷箱冰冻切片机(美国AO产)作连续冠状切片，片厚40um，切片隔一留一，收集于0.01mol/L磷酸缓冲液内(PBS，PH 7.4，下同)。
, 百拇医药
1.2.3 组织化学反应。方法如下：切片经PBS充分漂洗，入孵育液(配方：每毫升含0.1%Triton X-100的PBS中加NBT 0.6mg，上海东风产；加NADPH 0.5mg,Sigma TypeI)于37°C下60min。各反应孔的孵育液用量及入片数一致，各组切片同时进行。然后移入PBS中终止反应并漂洗3×10min，常规贴片、干燥、透明、封片。
1.2.4 切片观察、记数和数据处理。记数方法：参照Paxinos(1986)鼠脑定位图谱，以Bregma-1.80mm平面为基准，取该平面片及其前、后邻近片各一张，共三张进行计数。在400倍镜下，采用上海第三光学仪器厂C5型0.5网形目镜尺(实际划刻面积为5×5mm2，400倍镜下划刻面积为156.25um2)进行，记数与任一测点外上角和测线(横线)上缘交叉的NOS阳性神经元(记数标准为：胞浆染色较深、着色均匀、边界及细胞突起清楚、胞体中心核区明显)。每片于PVN各部相应处取二视野，分别计数，取均值即为该片该部的NOS阳性神经元密度值，将三片的相应值累加取均值，依此即得该鼠一侧PVN各部、一侧PVN和双侧PVN的NOS阳性神经元密度值。终值单位为：个/156.25um2。照相时取同一批次的切片进行。
, 百拇医药
2 实验结果
2.1 镜下观察 NOS阳性神经元胞浆呈兰色，色泽鲜艳，核不着色，突起明显；神经纤维呈兰色，可见串珠状特征。
2.2 NOS阳性神经元在PVN及其各部(双侧)的密度及其组间两两比较(见表1)。
表1：NOS阳性神经元在PVN及其各部(双侧)的表密度及组间两两比较
单位：个/156.25um2 组别
n
编号
PaV
PaMP
PaLM
, 百拇医药
PVN
手针组
5
1
9.88±0.57
6.67±0.30
10.75±0.65
9.10±0.15
对照组
5
2
7.79±0.96
4.75±0.50
, 百拇医药
7.21±0.53
6.56±0.52
空白组
5
3
3.58±0.29
3.37±0.42
5.50±0.83
4.04±0.23
*
*
*
*
, 百拇医药
注：F检验P<0.01，*两两比较均P<0.01，PaV：室旁核腹侧部，PaMP：室旁核内侧小细胞部，PaLM：室旁核外侧大细胞部.
由表中可以看出，各组间PVN及其各部的阳性细胞密度存在显著差异(P<0.01)，由高至低排列顺序为手针组>对照组>空白组(P<0.01)；对照组各部均比空白组显著增高(P<0.01)。说明：手针组刺激可使PVN神经元的NOS活性进一步显著增高(P<0.01)，这种变化主要由其各部的相应增高所致。
2.3 NOS阳性神经元在PVN及其各部(单侧)的分布密度及组内同、对侧比较(见表2)。
由表中可以看出，各组PVN及其各部的NOS阳性神经元密度值不是一致的。手针组同侧显著高于对侧，主要表现在同侧PaV(P<0.01)；对照组和空白组同、对侧及其各部间无差异(P>0.05)。以上说明：手针组刺激导致了两侧PVN神经元NOS活性的差异，同侧高于对侧，此变化主要表现在PaV。麻醉刺激不导致两侧差异。
, 百拇医药
表2 NOS阳性神经元在PVN及其各部(单侧)的密度及同、对侧比较
单位：个/156.25um2 组别
例数
侧别
PaV
PaMP
PaLM
PVN
手针组
5
同侧
11.50±0.69*
, 百拇医药
6.75±0.32
11.00±0.61
9.57±0.17*
对侧
8.25±0.57
6.58±0.32
10.50±0.84
8.45±0.16
对照组
5
同侧
7.75±0.17
, 百拇医药
4.83±0.43
7.34±1.41
6.64±0.83
对侧
7.67±0.98
4.67±0.61
7.08±1.29
6.47±0.39
空白组
5
同侧
3.42±0.32
, 百拇医药
3.41±0.49
5.52±0.42
4.06±0.23
对侧
3.75±0.32
3.32±0.45
4.92±0.32
4.03±0.24
注：*与对侧P>0.01
2.4 各组NOS照片见附图片1～3。
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1 空白组 40X2 对照组 40X 3 手针组 40X
3 讨论
3.1 无机气体分子NO是一种全新的重要信息物质，不论是在中枢或外周神经系统都担负着重要的信号传导任务，它既是第二信使，又是一种神经递质，在中枢具有调节神经元活动、介导兴奋性传导，影响递质分泌等功能[5]。NOS在PVN神经元中含量较高，且与AVP、等多种物质共存，提示NO对PVN神经元神递质的分泌具有调节作用[6]。本实验结果显示：手针刺激右“肾俞”穴所至PVN神经元NOS活性改变的组间差异、组内同对侧差异十分显著，甚至在同一侧PNV的不同部分差异也非常明显，因此提示：(1)手针刺激“肾俞”穴导致了PVN神经元功能状态的改变，在此过程中NO发挥作用；(2)PVN神经元对同一方法刺激单侧“肾俞”穴的这种反应上的同、对侧差异，可能是导致“肾俞”穴针刺效应两侧差异的重要环节之一。
, http://www.100md.com 3.2 关于“肾俞”穴针刺效应机理，国内外已有一些研究报道，虽各自的研究方法和着重点不同，但结果基本一致，即：神经-内分泌系统在针刺效应中具有及其重要的作用[1，2，4]。神经生物研究揭示，PVN是神经体液调节的关键部位之一，它既具有神经内分泌的功能，又参与植物神经的控制，在实现交感—肾上腺髓质和下丘脑-垂体-肾上腺皮质两大系统的整合中起着重要作用。神经电生理学研究显示，电刺激PNV可引起ACTH的分泌，PVN参与调节肾交感神经节前神经元的传出活动[7]，参与肾神经传入所引起的升血ACTH效应等等[8]。
鉴于本实验研究的结果证明PVN参与了“肾俞”穴的针刺效应且NO在其间发挥作用，因而可以设想：“肾俞”穴的针刺信息，在触发以背根节和交感神经节为中心的中枢外反射通路和脊髓低级中枢反射通路的同时可经背根节和脊髓的两次整合，上行(直接或间接)入PVN，使其神经元NOS活性发生改变，通过影响胞内NO水平进而调节其递质的分泌：一方面通过调节其投射到正中隆起纤维CRF和AVP的分泌，影响垂体前叶ACTH和β-EP的分泌，进而影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统，调节机体内分泌水平；调节其室旁核-脊髓路径CRF和AVP的释放，影响交感-肾上腺髓质系统，调节机体内脏运动的交感传出；另一方面通过调节其大神经分泌细胞VP的分泌，调节机体的水液代谢等。这一设想与现有的关于“肾俞”穴针刺效应的结论基本相符。其具体细节有待到进一步研究、证实。
, 百拇医药
3.3 针灸医学十分注重临证时选穴方法，如《灵枢缪刺》和《灵枢官针》都提到缪刺和巨刺，均有：“右取左，左取右”。《素问阴阳大论》也说：“故善用针者……以右治左、以左治右”。本研究以手针刺激右“肾俞”穴，导致了下丘脑室旁核功能状态及NOS的同、对侧差异，亦即给予“肾俞”穴的同一刺激对室旁核的影响“左、右”不同。因为两侧下丘脑室旁核不同的功能状态，势必会导致其对机体器官功能“左，右”影响的差异，所以，本研究结果，实际上为巨刺、缪刺“右取左，左取右，以左治右，以右治左”的刺穴方法和针刺效应的表达提供了直接的神经形态学证据。
参考文献
1 中村克彦.针治疗の肾生理学的作用への影响.医学のるヰり，昭和59年，128(1)：27～28
2 赵相杰等.针刺对注入地塞米松的大鼠之中枢5-HT和肾上腺皮质系统的影响.中国针灸，1982，(5)：28～30
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3 华兴帮.大白鼠穴位图谱的研制.实验动物与动物实验，1991， (1)：1～3.
4 蔡乃真等.针刺家免“肾俞”穴利尿利钠作用的研究.上海针灸杂志，1993，12(4)：169～171
5 路长林.一氧化氮.韩济生等主编.医学神经生物学.武汉出版社，1996，145～147
6 Vandeande F,et al. Identification of the vasopressin producing and oxytocin producing neurons in the hypothalamic magnocellular system of the rat.Cell Tis Res,1975，164:153～162
7 秦素丽等.免室旁核-脊髓经路对血量扩张引起肾交感神经活动抑制的作用.生理学报，1994，46(3)：217～225
8 詹昌德等.室旁核在刺激肾神经传入纤维对血浆皮质醇浓度影响中的作用.生理学报，1993，45(3)：305～309, 百拇医药
单位：湖北中医学院解剖教研室(430061)
关键词：
湖北中医杂志99zk117 临床和实验研究显示，针刺“肾俞”穴具有影响机体下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能，影响肾的泌尿功能等多方面的效应，提示神经体液因素在这一效应中的重要作用[1，2]，而作为神经-内分泌系统关键中枢核团之一的下丘脑室旁核(Hypothalanic Paraventricular nucleus,PVN,下同)对针刺“肾俞”穴反应如何却未见报道。为此，本文采用组织化学方法，着重观察了手捻针刺激大鼠右“肾俞”穴对PVN NOS-NADPH阳性神经元(以下简称NOS)的影响，拟为信息物质NO参与“肾俞”穴针刺效应提供形态学依据。
1 材料和方法
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1.1 材料Wistar大鼠，15只，重量220-250克，雌雄不限。随机分成三组：手针组；对照组；空白组。每组5只。
1.2 方法
1.2.1 取穴、麻醉和穴位刺激：参照华兴邦的大鼠穴位图谱[3]，于第二腰椎棘突下右侧旁开7mm取右“肾俞”穴，直刺8mm。采用甲氧氟烷吸入加1%戊巴比妥钠腹腔注射的复合麻醉方式。手针组：麻醉+手针；对照组：只麻醉，不刺激；空白组；不麻醉，不刺激。手针采用手捻针刺激10分钟，留针20分钟，运针频率控制在4次/秒，捻针幅度360度左右，中等强度[4]。每次实验各组均取一只同时进行。
1.2.2 材料制备：从刺激开始计2小时，各动物在戊巴比妥钠深麻下，开胸作经左心窒4°C 4%多聚甲醛(PB配制，PH7.4)灌注固定，灌毕即取脑，4°C后固定过夜，入含30%蔗糖的PB内4°C沉底，恒冷箱冰冻切片机(美国AO产)作连续冠状切片，片厚40um，切片隔一留一，收集于0.01mol/L磷酸缓冲液内(PBS，PH 7.4，下同)。
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1.2.3 组织化学反应。方法如下：切片经PBS充分漂洗，入孵育液(配方：每毫升含0.1%Triton X-100的PBS中加NBT 0.6mg，上海东风产；加NADPH 0.5mg,Sigma TypeI)于37°C下60min。各反应孔的孵育液用量及入片数一致，各组切片同时进行。然后移入PBS中终止反应并漂洗3×10min，常规贴片、干燥、透明、封片。
1.2.4 切片观察、记数和数据处理。记数方法：参照Paxinos(1986)鼠脑定位图谱，以Bregma-1.80mm平面为基准，取该平面片及其前、后邻近片各一张，共三张进行计数。在400倍镜下，采用上海第三光学仪器厂C5型0.5网形目镜尺(实际划刻面积为5×5mm2，400倍镜下划刻面积为156.25um2)进行，记数与任一测点外上角和测线(横线)上缘交叉的NOS阳性神经元(记数标准为：胞浆染色较深、着色均匀、边界及细胞突起清楚、胞体中心核区明显)。每片于PVN各部相应处取二视野，分别计数，取均值即为该片该部的NOS阳性神经元密度值，将三片的相应值累加取均值，依此即得该鼠一侧PVN各部、一侧PVN和双侧PVN的NOS阳性神经元密度值。终值单位为：个/156.25um2。照相时取同一批次的切片进行。
, 百拇医药
2 实验结果
2.1 镜下观察 NOS阳性神经元胞浆呈兰色，色泽鲜艳，核不着色，突起明显；神经纤维呈兰色，可见串珠状特征。
2.2 NOS阳性神经元在PVN及其各部(双侧)的密度及其组间两两比较(见表1)。
表1：NOS阳性神经元在PVN及其各部(双侧)的表密度及组间两两比较
单位：个/156.25um2 组别
n
编号
PaV
PaMP
PaLM
, 百拇医药
PVN
手针组
5
1
9.88±0.57
6.67±0.30
10.75±0.65
9.10±0.15
对照组
5
2
7.79±0.96
4.75±0.50
, 百拇医药
7.21±0.53
6.56±0.52
空白组
5
3
3.58±0.29
3.37±0.42
5.50±0.83
4.04±0.23
*
*
*
*
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注：F检验P<0.01，*两两比较均P<0.01，PaV：室旁核腹侧部，PaMP：室旁核内侧小细胞部，PaLM：室旁核外侧大细胞部.
由表中可以看出，各组间PVN及其各部的阳性细胞密度存在显著差异(P<0.01)，由高至低排列顺序为手针组>对照组>空白组(P<0.01)；对照组各部均比空白组显著增高(P<0.01)。说明：手针组刺激可使PVN神经元的NOS活性进一步显著增高(P<0.01)，这种变化主要由其各部的相应增高所致。
2.3 NOS阳性神经元在PVN及其各部(单侧)的分布密度及组内同、对侧比较(见表2)。
由表中可以看出，各组PVN及其各部的NOS阳性神经元密度值不是一致的。手针组同侧显著高于对侧，主要表现在同侧PaV(P<0.01)；对照组和空白组同、对侧及其各部间无差异(P>0.05)。以上说明：手针组刺激导致了两侧PVN神经元NOS活性的差异，同侧高于对侧，此变化主要表现在PaV。麻醉刺激不导致两侧差异。
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表2 NOS阳性神经元在PVN及其各部(单侧)的密度及同、对侧比较
单位：个/156.25um2 组别
例数
侧别
PaV
PaMP
PaLM
PVN
手针组
5
同侧
11.50±0.69*
, 百拇医药
6.75±0.32
11.00±0.61
9.57±0.17*
对侧
8.25±0.57
6.58±0.32
10.50±0.84
8.45±0.16
对照组
5
同侧
7.75±0.17
, 百拇医药
4.83±0.43
7.34±1.41
6.64±0.83
对侧
7.67±0.98
4.67±0.61
7.08±1.29
6.47±0.39
空白组
5
同侧
3.42±0.32
, 百拇医药
3.41±0.49
5.52±0.42
4.06±0.23
对侧
3.75±0.32
3.32±0.45
4.92±0.32
4.03±0.24
注：*与对侧P>0.01
2.4 各组NOS照片见附图片1～3。
, http://www.100md.com
1 空白组 40X2 对照组 40X 3 手针组 40X
3 讨论
3.1 无机气体分子NO是一种全新的重要信息物质，不论是在中枢或外周神经系统都担负着重要的信号传导任务，它既是第二信使，又是一种神经递质，在中枢具有调节神经元活动、介导兴奋性传导，影响递质分泌等功能[5]。NOS在PVN神经元中含量较高，且与AVP、等多种物质共存，提示NO对PVN神经元神递质的分泌具有调节作用[6]。本实验结果显示：手针刺激右“肾俞”穴所至PVN神经元NOS活性改变的组间差异、组内同对侧差异十分显著，甚至在同一侧PNV的不同部分差异也非常明显，因此提示：(1)手针刺激“肾俞”穴导致了PVN神经元功能状态的改变，在此过程中NO发挥作用；(2)PVN神经元对同一方法刺激单侧“肾俞”穴的这种反应上的同、对侧差异，可能是导致“肾俞”穴针刺效应两侧差异的重要环节之一。
, http://www.100md.com 3.2 关于“肾俞”穴针刺效应机理，国内外已有一些研究报道，虽各自的研究方法和着重点不同，但结果基本一致，即：神经-内分泌系统在针刺效应中具有及其重要的作用[1，2，4]。神经生物研究揭示，PVN是神经体液调节的关键部位之一，它既具有神经内分泌的功能，又参与植物神经的控制，在实现交感—肾上腺髓质和下丘脑-垂体-肾上腺皮质两大系统的整合中起着重要作用。神经电生理学研究显示，电刺激PNV可引起ACTH的分泌，PVN参与调节肾交感神经节前神经元的传出活动[7]，参与肾神经传入所引起的升血ACTH效应等等[8]。
鉴于本实验研究的结果证明PVN参与了“肾俞”穴的针刺效应且NO在其间发挥作用，因而可以设想：“肾俞”穴的针刺信息，在触发以背根节和交感神经节为中心的中枢外反射通路和脊髓低级中枢反射通路的同时可经背根节和脊髓的两次整合，上行(直接或间接)入PVN，使其神经元NOS活性发生改变，通过影响胞内NO水平进而调节其递质的分泌：一方面通过调节其投射到正中隆起纤维CRF和AVP的分泌，影响垂体前叶ACTH和β-EP的分泌，进而影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统，调节机体内分泌水平；调节其室旁核-脊髓路径CRF和AVP的释放，影响交感-肾上腺髓质系统，调节机体内脏运动的交感传出；另一方面通过调节其大神经分泌细胞VP的分泌，调节机体的水液代谢等。这一设想与现有的关于“肾俞”穴针刺效应的结论基本相符。其具体细节有待到进一步研究、证实。
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3.3 针灸医学十分注重临证时选穴方法，如《灵枢缪刺》和《灵枢官针》都提到缪刺和巨刺，均有：“右取左，左取右”。《素问阴阳大论》也说：“故善用针者……以右治左、以左治右”。本研究以手针刺激右“肾俞”穴，导致了下丘脑室旁核功能状态及NOS的同、对侧差异，亦即给予“肾俞”穴的同一刺激对室旁核的影响“左、右”不同。因为两侧下丘脑室旁核不同的功能状态，势必会导致其对机体器官功能“左，右”影响的差异，所以，本研究结果，实际上为巨刺、缪刺“右取左，左取右，以左治右，以右治左”的刺穴方法和针刺效应的表达提供了直接的神经形态学证据。
参考文献
1 中村克彦.针治疗の肾生理学的作用への影响.医学のるヰり，昭和59年，128(1)：27～28
2 赵相杰等.针刺对注入地塞米松的大鼠之中枢5-HT和肾上腺皮质系统的影响.中国针灸，1982，(5)：28～30
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3 华兴帮.大白鼠穴位图谱的研制.实验动物与动物实验，1991， (1)：1～3.
4 蔡乃真等.针刺家免“肾俞”穴利尿利钠作用的研究.上海针灸杂志，1993，12(4)：169～171
5 路长林.一氧化氮.韩济生等主编.医学神经生物学.武汉出版社，1996，145～147
6 Vandeande F,et al. Identification of the vasopressin producing and oxytocin producing neurons in the hypothalamic magnocellular system of the rat.Cell Tis Res,1975，164:153～162
7 秦素丽等.免室旁核-脊髓经路对血量扩张引起肾交感神经活动抑制的作用.生理学报，1994，46(3)：217～225
8 詹昌德等.室旁核在刺激肾神经传入纤维对血浆皮质醇浓度影响中的作用.生理学报，1993，45(3)：305～309, 百拇医药