细胞端粒酶活性定量检测在良恶性胸腹水中鉴别诊断的价值
【摘要】 目的 探讨端粒酶活性检测对良恶性胸腹水中的鉴别诊断的价值。方法 采用TRAP-银染定性法和TRAP-PicoGreen定量法，对102例患者胸水和腹水进行端粒酶活性分析。结果 端粒酶定性和定量结果均显示恶性组端粒酶活性水平显著高于良性组(P<0.05)，定量检测细胞端粒酶活性和定性检测相比，可提高肿瘤检测的敏感性。结论 端粒酶活性定量检测有助于良恶性胸腹水的诊断和鉴别诊断。
关键词 端粒酶 胸水 腹水 肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)06-0779-04
The diagnostic value of hydrothorax and hydroperitoneum telomerase
activity in distinguishing a malignant from a nonmalignant effusion
, http://www.100md.com
Yue Zhihong，Zhang Zheng，Ma Liping，et al.
The Pepole’s Hospital，Peking University，Beijing100044.
【Abstract】 Objective To study on the clinical value of telomerase activity in ascites/pleural effusions.Methods The telomerase activity in ascites/pleural effusions was detected in102specimens of effeusion cells by TRAP-PicoGreen assay and the results of detecting telomerase activity was compared with the cytological diagnosis.Results Positive rate of telomerase activity in malignant groups was significant higher than that detected in benign groups(P<0.05).Conclusion Detection of telomerase activity in the effusions can be a promising diagnostic method in differential diagnosis of benign and malignant ascites/pleural effusions.
, 百拇医药
Key words telomerase activity pleural effusion ascites tumor
正常细胞中端粒随细胞分裂呈进行性缩短，端粒酶是一种逆转录DNA合成酶，具有使端粒延伸并维持其稳定的作用。它的激活可稳定端粒长度甚至使细胞获得永生。由于大多数恶性肿瘤及细胞株端粒酶活性高表达，因此端粒酶是目前已知的最通用的肿瘤分子标志物。本文采用TRAP-PicoGreen方法定量检测了102例胸水和腹水标本中端粒酶活性，探讨其在鉴别良恶性胸腹水中的诊断价值。
1 资料与方法
1.1 病例选择 本院和北大医院自2003年3月～2004年1月102例患者的胸水和腹水标本。恶性组60例，男25例，女35例，年龄32～90岁，其中肺癌23例，卵巢癌15例，肝癌6例，乳腺癌6例，子宫内膜癌3例，胃癌2例，直肠癌、恶性横纹肌瘤、白血病、胰腺癌、膀胱癌转移各1例。见图1。良性组42例，男27例，女15例，年龄15～91岁，其中结核性21例(结核性胸膜炎20例，结核性腹膜炎1例)，肝硬化7例，肺炎6例，肾衰4例，心衰2例，脊髓炎1例，腹膜浆液性囊肿瘤1例。所有病例诊断均经病理学和(或)影像学证实。胸水收集前2～3周患者均未接受化疗。阳性对照k562细胞由本院中心实验室提供。体液脱落细胞病理学诊断由本院和北大医院病理科提供。
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1.2 方法
1.2.1 细胞端粒酶提取 取新鲜胸水或腹水标本100ml，对混有红细胞的血性标本加入红细胞裂解液摇匀，室温静置20min。4℃3000rpm离心10min，弃去上清，反复裂解3 次，直至细胞变白。加入DEPC处理过的PBS洗涤，4℃3000rpm离心10min，弃上清，反复2次。加入预冷的细胞裂解液100μl，其中PMSF单独加入1μl，冰浴30min。4℃16000rpm离心20min吸取上清置-70℃保存备用。
1.2.2 蛋白浓度测定(Branford法) 以牛血清白蛋白(BSA)配制标准蛋白溶液。分别取20μl加入1000μl考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue G-250)蛋白反应液，混匀，室温静置2min后在分光光度计595nm测定光吸收值。以蛋白浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线，线性范围为0～1.5μg/μl。即可相应测定标本的蛋白浓度。该方法为定量端粒酶的基础。
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1.2.3 TRAP扩增 在50μl反应体系中加入反应液40μl，标本7.5μl(蛋白含量最高为6.0μg)后，于30℃反应60min，进行底物延伸。在延伸后产物中加入ACX引物2μl、Taq酶2.5单位、液体石蜡40μl，94℃预变性5min后循环25周，循环条件为变性(94℃)30s、退火(50℃)30s、延伸(72℃)90s，72℃后延伸10min后中止反应。每次TRAP反应时以k562细胞株1μg蛋白提取液作为阳性对照，不加标本提取液为阴性对照。
1.2.4 扩增产物检测
1.2.4.1 定性检测 将10μlTRAP产物与含溴酚蓝的6×凝胶载样缓冲液2μl混合，在120V的电压下，进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，直至电流使溴酚蓝色带泳出凝胶为止。固定银染显色后，出现4条以上间隔6bp的梯度条带者为端粒酶活性阳性，否则为阴性。
1.2.4.2 定量检测 取TRAP产物4μl，加入PicoGreen工作液200μl混匀5min后于激发波长480nm、发射波长520nm读图1 病例分组1=结核，2=肝硬化，3=肺炎，4=其它良性，6=肺癌，7=卵巢癌，8=肝癌，9=乳腺癌，10=其它恶性取荧光值。以鲑鱼精DNA配制标准DNA溶液，绘制标准曲线，线性范围为0～200ng/ml，即可相应测定产物的DNA浓度。实际荧光值为每个样本实测值减去阴性对照后的结果。从而计算每微克蛋白催化产生的DNA量(ngDNA/μg蛋白，以下简称为ng/μg)。与银染结果比较，端粒酶活性在约20ng/μg以上时，银染结果阳性，反之则为阴性。本次实验阳性对照的端粒酶活性为(65.67±16.72)ng/μg。
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1.3 统计学方法 端粒酶活性以均值±标准差表示，所有数据均由Microsoft Excel2000和SPSS10.0软件处理。两组间计数资料比较采用χ 2 检验，计量资料比采用t或t′检验。三组间计量资料比较采用ANOVA。P<0.05，样本间均数差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体液细胞端粒酶活性定性检测结果 在102例胸水和腹水中，60例恶性组端粒酶阳性检出率68.3%(41/60)显著高于42例良性组端粒酶阳性检出率21.4%(9/42)(χ 2 =21.750，P<0.05)。其中60例恶性组端粒酶活性定性检测结果和脱落细胞病理学诊断比较见表1。在60例恶性组中，经端粒酶活性定性检测，其中25例病理学检查阳性者有19例端粒酶活性呈阳性，4例病理学可疑者有3例端粒酶活性阳性;31例病理学阴性者有19例端粒酶活性阳性，共有41例检测到端粒酶活性。端粒酶阳性检出率68.3%(41/60)与病理学诊断的阳性率48.3%(29/60)比较，差异有显著性(χ 2 =4.654，P<0.05)。其中病理学阴性者19/31(61.3%)与病理学阳性者端粒酶阳性检出率22/29(75.9%)比较，差异无显著性(χ 2 =1.470，P>0.05)。
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表1 60例恶性组病理学诊断与端粒酶活性定性检测结果
2.2 体液细胞端粒酶活性的定量检测结果 在102例胸水和腹水中，恶性组端粒酶活性水平与良性组比较，两组间差异有统计学意义(t′=6.801，P<0.05)，结果见表2。以体液细胞中不同端粒酶活性水平做为鉴别良恶性体液的cut-off值，则可计算其敏感性和特异性，根据结果可绘出端 粒酶定量检测的ROC曲线，结果见表3和图2。根据ROC曲线可知，端粒酶活性的cut-off值设定为18ng/μg，其敏感性为71.67%(43/60)，特异性为71.43%(30/42)。图2 体液细胞端粒酶活性的ROC曲线
表2 102例端粒酶活性水平的比较
表3 端粒酶检测的敏感性和特异性
2.3 结核组、非结核组和肺癌组端粒酶活性的比较 在102例胸水和腹水中，良性组和恶性组中不同标本端粒酶活性水平的分布见图2。对结核组、非结核组和肺癌组端粒酶活性分别进行统计，由方差分析可知，肺癌组与结核组和非结核组之间端粒酶活性水平差异有统计学意义(P<0.05)，而结核组与非结核组之间无统计学意义，结果见表4。但从统计数据仍可看到结核患者的体液中表达低水平的端粒酶活性。
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表4 结核组端粒酶活性与非结核组和肺癌组端粒酶活性的比较
2.4 结核组对端粒酶活性定量检测ROC曲线影响 将结核组21例数据除外，以体液细胞中不同端粒酶活性水平做为鉴别良恶性体液的cut-off值，则可计算其敏感性和特异性，根据结果可绘出端粒酶定量检测的ROC曲线。根据ROC曲线可知，此时端粒酶活性的cut-off值若设定为18ng/μg，则其敏感性为71.67%(43/60)，特异性达到80.95%(17/21)。
3 讨论
恶性胸腹水常有一定数量的肿瘤细胞，病理学检查是目前癌性胸水或腹水诊断的主要方法，具有较高的特异性，但敏感性易受取样标本的保存、涂片、染色方法和读片经验等影响。一般在已知肿瘤患者中敏感性为50%～75% [1] 。我们例行常规检测，恶性胸腹水细胞学诊断的阳性率为48.3%。Kim等 [2] 建立端粒重复序列扩增法(telomere repeat amˉplification protocal，TRAP)及其改良方法后，各种组织的穿刺标本，胸腹水，尿液或膀胱冲洗液 [3] ，支气管肺泡灌洗液 [4] ，脑脊液 [5] 中端粒酶活性的检测已有文献报道，尽管体液中细胞端粒酶活性检测的敏感性和特异性均低于组织标本 [6～8] ，体液细胞端粒酶活性检测仍可成为恶性肿瘤的一种通用和特异的肿瘤诊断指标。Yang等 [9] 检测了144例胸水或腹水患者，恶性胸水70例，端粒酶阳性率为91.4%，可疑恶性胸水22例，阳性率为90.9%，非恶性胸水52例，阳性率为5.8%。另一组72例腹水中，16例腹腔肿瘤有13例(81.3%)和9例肝细胞癌有6例(66.7%)表达端粒酶活性;而病理学阳性率仅为56.3%和11.1%。47例非恶性腹水有2例(4.3%)端粒酶阳性[10] 。但在以往众多文献报道中，端粒酶活性检测采用定性方法。不同类型肿瘤端粒酶阳性率各有差异，而且未见端粒酶活性表达水平高低的报道。
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除肿瘤细胞之外，正常组织或良性病变组织来源的细胞亦可表达端粒酶活性，部分血液细胞、上皮细胞及生殖细胞中有低活性的端粒酶表达，因此必须建立端粒酶活性检测定量方法来确定端粒酶活性阈值。本实验采用Kim等 [2] 建立的TRAP和Gelmini等 [11] 建立的敏感性荧光染料PicoGreen特异地与TRAP扩增产物双链DAN结合起来，定量检测端粒酶活性的方法测定了60例恶性组和42例良性组胸腹水标本端粒酶活性，恶性组为(36.66±22.85)ng/μg，而良性组端粒酶活性则为(14.72±7.97)ng/μg。尽管良性组和恶性组端粒酶活性有少量重叠区域的存在，恶性组端粒酶活性水平显著高于良性组。不同类型肿瘤端粒酶活性差别较大，且同一肿瘤端粒酶活性呈散在分布。
如果实际应用中以端粒酶活性做为恶性肿瘤的诊断指标，建立鉴别良恶性胸腹水的端粒酶活性的cut-off值，将是非常有用的。尽管良性组中亦有病例检测到端粒酶活性，但经过端粒酶活性定量检测数据ROC曲线分析可知，以18ng/μg为cut-off值，则端粒酶活性检测的敏感性为71.67%，特异性为71.43%。由此可见，端粒酶活性水平的定量检测可以做为良恶性胸腹水的鉴别诊断指标，对肿瘤的恶性度作出分级。更为重要的是，在恶性组中病理学诊断阴性标本其端粒酶活性检测的阳性率和病理学诊断阳性标本比较，结果差异无显著性。所以，对于病理学诊断阴性标本，端粒酶活性的检测可做为良恶性胸腹水的鉴别诊断的重要补充指标。
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和其它报道端粒酶阳性率相比，此次实验端粒酶活性定量检测阳性率较低。这可能是主要或部分与体液中淋巴细胞或炎症细胞浸润有关 [12] 。体液中往往含有大量细胞成分，包括血细胞、间皮细胞等。人体正常的T细胞和B细胞可检测到低活性的端粒酶，而单核细胞和粒细胞未检测到端粒酶活性。由于存在具有端粒酶活性的单个核细胞浸 润，使体液细胞端粒酶活性检测结果出现假阳性或者是高估样本中端粒酶活性。
另一方面，更为重要的是如果正常的外周血单个核细胞体外有抗原刺激存在，使淋巴细胞增殖和分化，端粒酶活性可显著升高。有文献报道，在体外PPD可显著促进肺结核患者外周血单个核细胞增殖，表达端粒酶活性 [13] 。而在端粒酶定性检测发现13例结核性胸水中有3例端粒酶结果阳性 [9] ，7例结核性腹水中有1例端粒酶活性阴性 [10] 。本次实验21例结核性体液中亦有5例端粒酶活性定性检测阳性，且结核组端粒酶活性水平高于非结核组。去除良性组织结核性病例结果影响，当以18ng/μg为cut-off值，则端粒酶活性检测的敏感性为71.67%，而特异性由71.43%提高到80.95%，端粒酶活性定量检测的阳性预测值显著升高。因此，结核性体液中表达低水平的端粒酶活性，在端粒酶活性水平鉴别诊断良恶性体液时造成假阳性。
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另外，恶性组端粒酶活性显著高于良性组。因此必须阐明这些淋巴细胞是否为肿瘤发生过程中免疫防御中特殊活化。因此需要通过hTERT表达原位检测，进一步研究端粒酶活化。免疫组化或原位杂交可区分是哪些细胞参与端粒酶活化 [14，15] 。
总之，TRAP-PicoGreen定量法能比较不同标本之间端粒酶活性。与银染等定性方法相比，该方法敏感、简便、快捷，为其在临床的大规模应用提供了可行性。尽管如此，为提高定量检测端粒酶活性的质量，一些方法学问题仍有待解决。特别是在端粒酶延伸和PCR放大过程中引入内对照来监测试验过程。
参考文献
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作者单位:100044北京大学人民医院
北京友谊医院肝病中心
(收稿日期:2004-03-30)
(编辑李 阳), 百拇医药
关键词 端粒酶 胸水 腹水 肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)06-0779-04
The diagnostic value of hydrothorax and hydroperitoneum telomerase
activity in distinguishing a malignant from a nonmalignant effusion
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Yue Zhihong，Zhang Zheng，Ma Liping，et al.
The Pepole’s Hospital，Peking University，Beijing100044.
【Abstract】 Objective To study on the clinical value of telomerase activity in ascites/pleural effusions.Methods The telomerase activity in ascites/pleural effusions was detected in102specimens of effeusion cells by TRAP-PicoGreen assay and the results of detecting telomerase activity was compared with the cytological diagnosis.Results Positive rate of telomerase activity in malignant groups was significant higher than that detected in benign groups(P<0.05).Conclusion Detection of telomerase activity in the effusions can be a promising diagnostic method in differential diagnosis of benign and malignant ascites/pleural effusions.
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Key words telomerase activity pleural effusion ascites tumor
正常细胞中端粒随细胞分裂呈进行性缩短，端粒酶是一种逆转录DNA合成酶，具有使端粒延伸并维持其稳定的作用。它的激活可稳定端粒长度甚至使细胞获得永生。由于大多数恶性肿瘤及细胞株端粒酶活性高表达，因此端粒酶是目前已知的最通用的肿瘤分子标志物。本文采用TRAP-PicoGreen方法定量检测了102例胸水和腹水标本中端粒酶活性，探讨其在鉴别良恶性胸腹水中的诊断价值。
1 资料与方法
1.1 病例选择 本院和北大医院自2003年3月～2004年1月102例患者的胸水和腹水标本。恶性组60例，男25例，女35例，年龄32～90岁，其中肺癌23例，卵巢癌15例，肝癌6例，乳腺癌6例，子宫内膜癌3例，胃癌2例，直肠癌、恶性横纹肌瘤、白血病、胰腺癌、膀胱癌转移各1例。见图1。良性组42例，男27例，女15例，年龄15～91岁，其中结核性21例(结核性胸膜炎20例，结核性腹膜炎1例)，肝硬化7例，肺炎6例，肾衰4例，心衰2例，脊髓炎1例，腹膜浆液性囊肿瘤1例。所有病例诊断均经病理学和(或)影像学证实。胸水收集前2～3周患者均未接受化疗。阳性对照k562细胞由本院中心实验室提供。体液脱落细胞病理学诊断由本院和北大医院病理科提供。
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1.2 方法
1.2.1 细胞端粒酶提取 取新鲜胸水或腹水标本100ml，对混有红细胞的血性标本加入红细胞裂解液摇匀，室温静置20min。4℃3000rpm离心10min，弃去上清，反复裂解3 次，直至细胞变白。加入DEPC处理过的PBS洗涤，4℃3000rpm离心10min，弃上清，反复2次。加入预冷的细胞裂解液100μl，其中PMSF单独加入1μl，冰浴30min。4℃16000rpm离心20min吸取上清置-70℃保存备用。
1.2.2 蛋白浓度测定(Branford法) 以牛血清白蛋白(BSA)配制标准蛋白溶液。分别取20μl加入1000μl考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue G-250)蛋白反应液，混匀，室温静置2min后在分光光度计595nm测定光吸收值。以蛋白浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线，线性范围为0～1.5μg/μl。即可相应测定标本的蛋白浓度。该方法为定量端粒酶的基础。
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1.2.3 TRAP扩增 在50μl反应体系中加入反应液40μl，标本7.5μl(蛋白含量最高为6.0μg)后，于30℃反应60min，进行底物延伸。在延伸后产物中加入ACX引物2μl、Taq酶2.5单位、液体石蜡40μl，94℃预变性5min后循环25周，循环条件为变性(94℃)30s、退火(50℃)30s、延伸(72℃)90s，72℃后延伸10min后中止反应。每次TRAP反应时以k562细胞株1μg蛋白提取液作为阳性对照，不加标本提取液为阴性对照。
1.2.4 扩增产物检测
1.2.4.1 定性检测 将10μlTRAP产物与含溴酚蓝的6×凝胶载样缓冲液2μl混合，在120V的电压下，进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，直至电流使溴酚蓝色带泳出凝胶为止。固定银染显色后，出现4条以上间隔6bp的梯度条带者为端粒酶活性阳性，否则为阴性。
1.2.4.2 定量检测 取TRAP产物4μl，加入PicoGreen工作液200μl混匀5min后于激发波长480nm、发射波长520nm读图1 病例分组1=结核，2=肝硬化，3=肺炎，4=其它良性，6=肺癌，7=卵巢癌，8=肝癌，9=乳腺癌，10=其它恶性取荧光值。以鲑鱼精DNA配制标准DNA溶液，绘制标准曲线，线性范围为0～200ng/ml，即可相应测定产物的DNA浓度。实际荧光值为每个样本实测值减去阴性对照后的结果。从而计算每微克蛋白催化产生的DNA量(ngDNA/μg蛋白，以下简称为ng/μg)。与银染结果比较，端粒酶活性在约20ng/μg以上时，银染结果阳性，反之则为阴性。本次实验阳性对照的端粒酶活性为(65.67±16.72)ng/μg。
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1.3 统计学方法 端粒酶活性以均值±标准差表示，所有数据均由Microsoft Excel2000和SPSS10.0软件处理。两组间计数资料比较采用χ 2 检验，计量资料比采用t或t′检验。三组间计量资料比较采用ANOVA。P<0.05，样本间均数差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体液细胞端粒酶活性定性检测结果 在102例胸水和腹水中，60例恶性组端粒酶阳性检出率68.3%(41/60)显著高于42例良性组端粒酶阳性检出率21.4%(9/42)(χ 2 =21.750，P<0.05)。其中60例恶性组端粒酶活性定性检测结果和脱落细胞病理学诊断比较见表1。在60例恶性组中，经端粒酶活性定性检测，其中25例病理学检查阳性者有19例端粒酶活性呈阳性，4例病理学可疑者有3例端粒酶活性阳性;31例病理学阴性者有19例端粒酶活性阳性，共有41例检测到端粒酶活性。端粒酶阳性检出率68.3%(41/60)与病理学诊断的阳性率48.3%(29/60)比较，差异有显著性(χ 2 =4.654，P<0.05)。其中病理学阴性者19/31(61.3%)与病理学阳性者端粒酶阳性检出率22/29(75.9%)比较，差异无显著性(χ 2 =1.470，P>0.05)。
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表1 60例恶性组病理学诊断与端粒酶活性定性检测结果
2.2 体液细胞端粒酶活性的定量检测结果 在102例胸水和腹水中，恶性组端粒酶活性水平与良性组比较，两组间差异有统计学意义(t′=6.801，P<0.05)，结果见表2。以体液细胞中不同端粒酶活性水平做为鉴别良恶性体液的cut-off值，则可计算其敏感性和特异性，根据结果可绘出端 粒酶定量检测的ROC曲线，结果见表3和图2。根据ROC曲线可知，端粒酶活性的cut-off值设定为18ng/μg，其敏感性为71.67%(43/60)，特异性为71.43%(30/42)。图2 体液细胞端粒酶活性的ROC曲线
表2 102例端粒酶活性水平的比较
表3 端粒酶检测的敏感性和特异性
2.3 结核组、非结核组和肺癌组端粒酶活性的比较 在102例胸水和腹水中，良性组和恶性组中不同标本端粒酶活性水平的分布见图2。对结核组、非结核组和肺癌组端粒酶活性分别进行统计，由方差分析可知，肺癌组与结核组和非结核组之间端粒酶活性水平差异有统计学意义(P<0.05)，而结核组与非结核组之间无统计学意义，结果见表4。但从统计数据仍可看到结核患者的体液中表达低水平的端粒酶活性。
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表4 结核组端粒酶活性与非结核组和肺癌组端粒酶活性的比较
2.4 结核组对端粒酶活性定量检测ROC曲线影响 将结核组21例数据除外，以体液细胞中不同端粒酶活性水平做为鉴别良恶性体液的cut-off值，则可计算其敏感性和特异性，根据结果可绘出端粒酶定量检测的ROC曲线。根据ROC曲线可知，此时端粒酶活性的cut-off值若设定为18ng/μg，则其敏感性为71.67%(43/60)，特异性达到80.95%(17/21)。
3 讨论
恶性胸腹水常有一定数量的肿瘤细胞，病理学检查是目前癌性胸水或腹水诊断的主要方法，具有较高的特异性，但敏感性易受取样标本的保存、涂片、染色方法和读片经验等影响。一般在已知肿瘤患者中敏感性为50%～75% [1] 。我们例行常规检测，恶性胸腹水细胞学诊断的阳性率为48.3%。Kim等 [2] 建立端粒重复序列扩增法(telomere repeat amˉplification protocal，TRAP)及其改良方法后，各种组织的穿刺标本，胸腹水，尿液或膀胱冲洗液 [3] ，支气管肺泡灌洗液 [4] ，脑脊液 [5] 中端粒酶活性的检测已有文献报道，尽管体液中细胞端粒酶活性检测的敏感性和特异性均低于组织标本 [6～8] ，体液细胞端粒酶活性检测仍可成为恶性肿瘤的一种通用和特异的肿瘤诊断指标。Yang等 [9] 检测了144例胸水或腹水患者，恶性胸水70例，端粒酶阳性率为91.4%，可疑恶性胸水22例，阳性率为90.9%，非恶性胸水52例，阳性率为5.8%。另一组72例腹水中，16例腹腔肿瘤有13例(81.3%)和9例肝细胞癌有6例(66.7%)表达端粒酶活性;而病理学阳性率仅为56.3%和11.1%。47例非恶性腹水有2例(4.3%)端粒酶阳性[10] 。但在以往众多文献报道中，端粒酶活性检测采用定性方法。不同类型肿瘤端粒酶阳性率各有差异，而且未见端粒酶活性表达水平高低的报道。
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除肿瘤细胞之外，正常组织或良性病变组织来源的细胞亦可表达端粒酶活性，部分血液细胞、上皮细胞及生殖细胞中有低活性的端粒酶表达，因此必须建立端粒酶活性检测定量方法来确定端粒酶活性阈值。本实验采用Kim等 [2] 建立的TRAP和Gelmini等 [11] 建立的敏感性荧光染料PicoGreen特异地与TRAP扩增产物双链DAN结合起来，定量检测端粒酶活性的方法测定了60例恶性组和42例良性组胸腹水标本端粒酶活性，恶性组为(36.66±22.85)ng/μg，而良性组端粒酶活性则为(14.72±7.97)ng/μg。尽管良性组和恶性组端粒酶活性有少量重叠区域的存在，恶性组端粒酶活性水平显著高于良性组。不同类型肿瘤端粒酶活性差别较大，且同一肿瘤端粒酶活性呈散在分布。
如果实际应用中以端粒酶活性做为恶性肿瘤的诊断指标，建立鉴别良恶性胸腹水的端粒酶活性的cut-off值，将是非常有用的。尽管良性组中亦有病例检测到端粒酶活性，但经过端粒酶活性定量检测数据ROC曲线分析可知，以18ng/μg为cut-off值，则端粒酶活性检测的敏感性为71.67%，特异性为71.43%。由此可见，端粒酶活性水平的定量检测可以做为良恶性胸腹水的鉴别诊断指标，对肿瘤的恶性度作出分级。更为重要的是，在恶性组中病理学诊断阴性标本其端粒酶活性检测的阳性率和病理学诊断阳性标本比较，结果差异无显著性。所以，对于病理学诊断阴性标本，端粒酶活性的检测可做为良恶性胸腹水的鉴别诊断的重要补充指标。
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和其它报道端粒酶阳性率相比，此次实验端粒酶活性定量检测阳性率较低。这可能是主要或部分与体液中淋巴细胞或炎症细胞浸润有关 [12] 。体液中往往含有大量细胞成分，包括血细胞、间皮细胞等。人体正常的T细胞和B细胞可检测到低活性的端粒酶，而单核细胞和粒细胞未检测到端粒酶活性。由于存在具有端粒酶活性的单个核细胞浸 润，使体液细胞端粒酶活性检测结果出现假阳性或者是高估样本中端粒酶活性。
另一方面，更为重要的是如果正常的外周血单个核细胞体外有抗原刺激存在，使淋巴细胞增殖和分化，端粒酶活性可显著升高。有文献报道，在体外PPD可显著促进肺结核患者外周血单个核细胞增殖，表达端粒酶活性 [13] 。而在端粒酶定性检测发现13例结核性胸水中有3例端粒酶结果阳性 [9] ，7例结核性腹水中有1例端粒酶活性阴性 [10] 。本次实验21例结核性体液中亦有5例端粒酶活性定性检测阳性，且结核组端粒酶活性水平高于非结核组。去除良性组织结核性病例结果影响，当以18ng/μg为cut-off值，则端粒酶活性检测的敏感性为71.67%，而特异性由71.43%提高到80.95%，端粒酶活性定量检测的阳性预测值显著升高。因此，结核性体液中表达低水平的端粒酶活性，在端粒酶活性水平鉴别诊断良恶性体液时造成假阳性。
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另外，恶性组端粒酶活性显著高于良性组。因此必须阐明这些淋巴细胞是否为肿瘤发生过程中免疫防御中特殊活化。因此需要通过hTERT表达原位检测，进一步研究端粒酶活化。免疫组化或原位杂交可区分是哪些细胞参与端粒酶活化 [14，15] 。
总之，TRAP-PicoGreen定量法能比较不同标本之间端粒酶活性。与银染等定性方法相比，该方法敏感、简便、快捷，为其在临床的大规模应用提供了可行性。尽管如此，为提高定量检测端粒酶活性的质量，一些方法学问题仍有待解决。特别是在端粒酶延伸和PCR放大过程中引入内对照来监测试验过程。
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作者单位:100044北京大学人民医院
北京友谊医院肝病中心
(收稿日期:2004-03-30)
(编辑李 阳), 百拇医药