卵子冷冻技术发展呼唤卵子库的建立——访北京大学第一医院生殖与遗传中心主任李晓红博士
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长期以来，配子的保存一直是生殖医学研究领域的热点。尽管精子及胚胎冷冻已普遍用于不孕症治疗，但卵子冷冻由于技术难度较大，至今仍未得到广泛应用。北京大学第一医院生殖与遗传中心李晓红博士等经过多年研究，卵子冷冻技术已经比较成熟。截至目前，该中心已有15位女性应用冷冻卵子技术进行体外受精胚胎移植，使其中7名妇女获得临床妊娠，最早受孕的妇女将于下月生产。为了解卵子冷冻的相关技术及构建卵子库面临的一些问题，记者对该中心主任李晓红博士进行了采访。
据李晓红博士介绍，卵子冷冻技术作为辅助生殖领域的一项前沿技术，正在被越来越多的国家采用。该技术通过冷冻保存女性生殖细胞——卵子，待日后需要生育时借助辅助生殖技术达到生育目的。迄今为止，全世界已经有近100名应用冷冻卵子技术后出生的孩子。
卵子冷冻比胚胎冷冻有着更为广泛的应用前景，可以缓解胚胎冷冻所面临的伦理、法律、道德、宗教等多方面的问题(有些国家禁止胚胎冷冻，但允许进行卵子冷冻)。卵子冷冻还是妇女生育力的有效储备形式，是保存因卵巢功能早衰、盆腔疾病、手术或放化疗等原因而可能丧失卵巢功能的女性生育力的一种手段。
除此之外，卵子冷冻还有以下用途：①保存体外受精—胚胎移植(IVF-ET)中过剩的卵子。随着IVF-ET技术中促超排卵技术的提高，近一半的IVF治疗周期可产生剩余的卵子，如果能将这部分卵子冷冻保存，受精或妊娠不成功时就可避免再次排卵刺激及取卵手术，受精或妊娠成功后剩余的卵子可以备将来不时之需，或者可以捐赠给他人。②保存目前尚不想生育女性的卵子，为其提供将来优生优育的保障。③在少数情况下(如在取卵手术后，精子无法获得时)，将卵子及时冷冻也是重要的应变措施。
卵子冷冻的操作步骤
李博士向我们介绍了卵子冷冻过程。卵子从妇女体内通过手术取出后，首先要在冷冻保护剂里进行预处理，其主要目的是使卵子脱水。充分脱水后进行冷冻，目前国内外主要采用下列2种冷冻方法，一为程序化冷冻，即在程序冷冻仪(见右图)的特定设定下降温和冷冻，最后置于液氮中保存；另一种为超高速的玻璃化冷冻，卵子在冷冻保护剂里进行预处理后，用极快的速度直接将卵子置于液氮中冷冻保存。冷冻保护剂的成分、浓度和配比对冷冻卵子以后的复苏、受精和卵裂有着非常重要的意义。保存于-196℃液氮中的卵子，理论上可保存数百年，但目前也有学者认为不超过10年为宜，当然，这需要进一步的研究探讨。在预处理和冷冻的过程中，既要保证卵子达到足够脱水的状态，又要使冷冻保护剂对卵子的毒性最小化。李博士的经验是，在采用程序化冷冻方法时，适当增加预处理保护剂中蔗糖的浓度，可使冷冻卵子的存活率提高。
当冷冻保存的卵子需要受孕时即可进行解冻。解冻(复苏)需快速进行，一般直接将卵子从液氮中取出至室温状态，目的是防止冰晶形成，避免损伤细胞膜和线粒体、微管、微丝等细胞器。由于温度的剧烈变化还可能导致巨分子物质(如蛋白质)变性，因此复苏过程也需要使用保护剂。复苏之后存活的卵子，就可以采用IVF或卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术进行体外受精，然后进行胚胎移植。
李博士说，该中心采用“慢冻(即程序化冷冻)快融”技术进行卵子冷冻和复苏，冻融之后的卵子存活率达90%以上，高于其他国家的冷冻卵子存活率。李博士对该技术充满信心，认为该技术已经比较成熟，安全性和稳定性较高，有望在近2～3年内推广常规应用于临床。
卵子冷冻技术的难点及解决办法
李博士认为，卵子冷冻技术的2大难点是卵子脱水困难导致存活率降低和纺锤体受损导致受精率降低。卵子脱水困难的原因在于人卵母细胞是人体最大的细胞之一，含有大量的水分，而且比表面积(表面积/体积)小，细胞膜耐受温度变化的能力差，通透性差，细胞保护剂渗入较困难。如果脱水不充分，在降温过程中易形成冰晶，易刺破细胞膜和细胞器而降低存活率。这个问题的解决主要依赖于以下几点：①延长脱水时间，使卵子脱水更充分；②精确控制冻融的速率；③提高冷冻保护剂中蔗糖的浓度，目前广泛应用的保护剂的主要成分为12-丙二醇(PROH，细胞膜弥散保护剂)和蔗糖(细胞膜非弥散保护剂)。李教授等发现，适当提高蔗糖浓度可使细胞充分脱水，且不会出现细胞过度萎缩而使细胞膜塌陷，冻融卵子的存活率明显提高，达90%以上。
排卵时，卵子(次级卵母细胞)处于第二次减数分裂中期MⅡ期，此时纺锤体结构完整。完整的纺锤体对于受精时卵子完成第二次减数分裂、排出第二极体极为重要。但纺锤体对温度极为敏感，卵子冻融过程很容易损伤纺锤体。李博士认为，纺锤体在冻融过程受到损伤是必然的，但损伤后的纺锤体可以恢复，而且其恢复过程是时间依赖性的，只要掌握合适的受精时间就可提高受精率，李博士观察发现一般在解冻后3小时左右受精为宜。
卵子冷冻技术的安全性
李博士指出，卵子冷冻毕竟是一项新兴的技术，自1986年澳大利亚Chen等报告第1例冷冻卵子妊娠至今，仅有18年的时间，而且前15年做得并不好，都是零星的个例报告，因此冷冻卵子分娩的胎儿究竟安全性如何目前还缺乏证据。在卵子冷冻技术开展相对较多的意大利，Porcu等曾报告，对冷冻卵子胎儿所进行的产前遗传学检查和产后评估都是健康的。这些胎儿的远期安全性问题目前还在观察之中。
卵子冷冻技术的法律和伦理学问题
在卵巢过度刺激综合征(OHSS)患者中，卵子冷冻是胚胎冷冻的有效替代方法。因为，遗弃过多的冷冻胚胎是一个很常见的现象，因此也容易受到法律和伦理学质疑。而对于冷冻卵子而言，法律和伦理学质疑就相对小一些，但卵子毕竟作为生殖细胞，还是有其不同于其他体细胞的特殊性。李博士介绍，目前北京大学第一医院生殖与遗传中心冷冻保存的卵子均为试管婴儿使用剩余的卵子，并且都是由当事人主动提出保存。对于很多希望保存自己卵子的育龄妇女，他们目前仅作了登记，并未开展卵子冷冻工作。李博士指出，建设卵子库的技术问题目前已基本成熟，但相关法律法规和管理制度还需要进一步完善。只有这样，这项新的辅助生殖的技术才能造福更多有此需要的妇女。
卵子冷冻人工授精技术图示
相关文献链接
澳大利亚：
1986年，澳大利亚Chen首次报告了用冷冻卵子进行IVF并成功妊娠的例子。(Lancet 1986 1884)
1995年，澳大利亚Gook等和Kazem等报告，ICSI技术可应用于冷冻卵子的受精过程，而且该技术可提高受精率和冷冻率。(Hum Reprod 1995 10 2637 2650)
意大利：
1997年，意大利Porcu等首次采用ICSI技术，为1例有10年输卵管性不孕史的28岁女性的冷冻卵子进行受精，该患者成功分娩了一个足月健康女婴。(Fertik Sterik 1997 68 724)
Porcu等于2000年报告，其首期卵子冷冻计划共纳入了23例输卵管性不孕的妇女，其冰冻卵子存活率为59.5%(201/338例)，采用ICSI技术的受精率为64.4%，卵裂率为90.8%，3名妇女成功受孕，其中1名分娩1健康女婴；第二期卵子冷冻计划纳入了96名妇女，1502个冻融卵子的存活率为54.1%，受精率为57.7%，卵裂率为91.2%，16名妇女成功受孕，其中9名妇女共分娩了11名健康婴儿。同时，Porcu等还采用ICSI技术进行了冷冻精子和冷冻卵子受精、冷冻卵子和附睾及睾丸精子受精，并且都成功妊娠，分娩健康婴儿。(Mok Cekk Endocrin 2000 169 33)
西班牙：
Fosas等采用慢冻快融法，用7名健康志愿者捐献的88个卵子使4名妇女成功分娩了5名健康婴儿。(Hum Reprod 2003 18 1417)
报告冷冻卵子成功妊娠的国家还有美国、阿根廷、加拿大、韩国和德国。
(李博士的相关文章请参见《中华泌尿外科杂志》2004,25:199), http://www.100md.com