气管导管生物被膜电镜观察及其与呼吸机相关性肺炎的关系
气管导管生物被膜电镜观察及其与呼吸机相关性肺炎的关系
柏宏坚 何礼贤 瞿介明 胡必杰 王葆青 陈雪华 潘珏 董荔
摘 要 目的 观察气管导管内表面细菌生物被膜(BF)形成情况并初步探讨其在呼吸机相关性肺炎(VAP)发生中的作用。方法 用扫描电子显微镜和透射电子显微镜分别观察拔出的气管导管内表面，同时作下呼吸道和导管内壁细菌学检测。结果 76%(19/25)气管导管内壁覆盖不定型基质物，其平均插管时间[(10.7±7.9)天]，长于无不定型基质物覆盖的导管的插管时间[(2.1±0.8)天](P<0.05)；78%(14/18) 不定型基质物中含大量球菌或杆菌；导管内壁含致病菌的16例中，11例在插管期间即从下呼吸道分泌物中分离得到相同菌株；在7/8 VAP患者中，VAP病原体与导管内分离的病原体相同。结论 气管导管内细菌BF形成与插管时间密切相关，导管内细菌BF的存在可能与VAP病原体有一定相关性。
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关键词：生物膜；气管导管；电子显微镜；呼吸机相关性肺炎
呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia, VAP)是机械通气患者的严重并发症，其发生率和病死率较高，病情易反复，抗生素治疗效果较差，类似于细菌生物被膜(biofilm, BF)相关性感染。气管插管是VAP最主要的易患因素[1]，但关于其在VAP发病中作用机制研究较少。本研究使用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)和透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察气管导管内表面细菌BF形成情况并探讨其在VAP发病中的作用。
对象与方法
一、对象
25例患者(外科ICU 23例、呼吸ICU 2例)，男性21例、女性4例，平均年龄(48.4±13.4)岁(26～72岁)。术后患者19例、外伤患者4例、哮喘和脑出血患者各1例。平均插管时间(8.6±6.1)天(1～27天)，其中23例在气管插管期间使用了2种或2种以上抗生素。本组病例中8例(8/25) 在拔管前发生VAP，发病前平均插管(9.9±4.6)天。
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二、材料
1.培养基和试剂：M-H琼脂平板，巧克力平板，PBS缓冲液(pH 7.4)，2.5%戊二醛，1%锇酸，系列酒精，醋酸正戊酯，丙酮，醋酸铀，枸橼酸铅，618环氧树脂包埋液。
2.器材：PVC高容低压气囊气管导管，超薄切片机，CO2临界点干燥仪(HCP-2型)，离子溅射仪，透射电镜(JEM-1200EX)，扫描电镜(日立S-520型)。
三、方法
1.气管导管标本收集：1998年7月～1999年5月收集上海医科大学附属中山医院外科ICU和呼吸ICU住院患者拔出的气管导管(除外插管前肺部感染) (插管时间≥24 h)。用无菌生理盐水冲洗导管外壁和内壁，截取气管导管下端长2 cm导管标本，作采样接种。再截取邻近气管导管2 cm放置2.5%戊二醛溶液中固定。取2根气管导管(未用)作同样的处理为对照组。
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2.细菌学检测：无菌吸痰管从下呼吸道吸取的标本和棉签蘸取气管导管内表面获得标本，分别接种在MH琼脂平板和巧克力平板，35°C培养18～24 h。所有细菌使用IMS细菌鉴定药敏分析系统鉴定。
3.SEM标本制备：将气管导管标本先用戊二醛和锇酸双重固定，系列酒精脱水，醋酸正戊酯置换，CO2临界点干燥，离子溅射仪喷金，然后用扫描电镜观察、拍照。
4.TEM标本制备：用戊二醛固定标本2小时，无菌刀片刮取气管导管内表面物质，磷酸缓冲液漂洗，锇酸固定2小时，梯度酒精、丙酮脱水，618环氧树脂包埋液浸透包埋，切片厚度60～80 nm；醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜观察、拍照。
四、有关定义和标准
1.VAP的诊断标准：参照文献[2]。
, 百拇医药 2.呼吸道正常菌群：指草绿色链球菌、类白喉杆菌和非致病奈瑟菌。
结果
一、细菌学检测结果
25例气管导管内壁作细菌学采样，9例[平均插管时间(3.8±2.1)天]为无菌生长(3例)或正常菌群(6例)；另16例[平均插管时间(12.8±7.1)天]分离得到的细菌包括肠杆菌科细菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌等，其中11例(11/16)在拔管前从患者下呼吸道的吸引物中分离得到同种细菌。在8例VAP患者中，细菌学检测和SEM、TEM检测发现所有气管导管表面有细菌存在。7例(7/8)导管分离的细菌与VAP的病原体相同。VAP病原菌包括铜绿假单胞菌和不动杆菌各2例、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎球菌各1例。
二、SEM观察结果
, http://www.100md.com SEM显示76%(19/25)气管导管[平均插管时间(10.7±7.9)天]内表面覆盖融合的不定型基质物，其中16例(16/19)不定型基质物下，见到明显的杆状或球状细菌轮廓(图1，2)。另6例(6/25)[平均插管时间(2.1±0.8)天]未见或仅见少量小片状不定型基质物。2例对照组气管导管内表面无不定型基质物覆盖(图3)。这种不定型基质物是细菌BF的胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)或呼吸道分泌物粘多糖，在制作电镜标本时脱水浓缩后的产物。
三、TEM观察结果
18例(18/25)气管导管内表面获取了足够标本，用于制成TEM观察切片。在14例(14/18)切片中，基质物(BF中EPS或呼吸道分泌的粘多糖)包裹大量杆菌或球菌，细菌约1～2 μm(图4，5)。另4例(4/18)标本中仅见大量基质物，而无或偶见细菌，这可能是呼吸道分泌的粘多糖成分(图6)。SEM观察到的气管导管内表面的不定型基质物并不都是细菌BF，部分可能是呼吸道分泌的粘多糖。因此，可以认为本组病例中，14例(14/25)气管导管内表面有细菌BF的存在。
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讨论
近年来，一些研究证实发生感染的人工关节、导尿管、心脏人工瓣膜、静脉导管及各种体液引流管等表面大多有细菌BF的存在。如其它植入装置一样，由PVC材料制成的气管导管，细菌易在其表面粘附增殖，大量分泌EPS形成细菌BF。气管导管表面的细菌大多来源于口咽部或胃肠定植菌和外界病原体的直接接种。本组病例中，SEM和TEM观察发现14例(14/25)气管导管内表面有细菌BF的存在。气管导管内的气体和液体流动，吸痰时吸痰管机械碰撞可导致细菌BF移动、堆积或脱落，易使这种含有大量细菌的BF碎片脱落进入下呼吸道。文献报道聚集或粘附的细菌较相同数量分散细菌更易引起下呼吸道感染或肺炎[3]。因此这些含有大量相互聚集及粘附细菌的细菌BF碎片进入下呼吸道就更易引起其感染。在8例VAP中，7/8病原体与气管导管内菌株相同，提示气管导管内的细菌BF存在可能与VAP病原体之间存在一定相关性。
导管内壁有细菌存在的16例中，有5例在拔管前其下呼吸道内吸出物未发现相同细菌，这可能是由于全身使用的抗生素杀灭下呼吸道内细菌。抗生素因其难以到达气管导管内壁以及细菌BF的存在，因而难以杀灭气管导管内细菌。提示在抗生素杀灭肺部定植或感染的细菌以后，气管导管的细菌BF很可能成为肺部细菌再定植或感染的病原体重要来源，从而导致VAP病情反复和难以治愈。
, 百拇医药
尽管在电镜观察下细菌BF的EPS与呼吸道分泌的粘多糖难以区分，但呼吸道分泌的粘多糖并不干扰细菌的定植或细菌BF的形成，这些粘多糖可作为细菌的营养物质，可有助于细菌BF形成[4]。因此，呼吸道分泌的粘多糖并不影响气管导管内细菌BF在VAP发病中的作用。TEM观察发现4例(4/18)标本中仅见大量的基质物，而无成群或大量的细菌，这些不含细菌的物质很可能是呼吸道所分泌的粘多糖。因此，将SEM和TEM观察结果进行综合分析，有助于提高电镜观察气管导管细菌BF的准确性和特异性。
SEM观察发现19例的气管导管内表面有基质物覆盖，其平均插管时间[(10.7±7.9)天]，显著长于无或少量不定型基质物覆盖的6例[平均插管时间(2.1±0.8)天](P<0.05)，提示气管导管内细菌BF形成与插管持续时间有关，此与文献报道一致[5]。因此，临床上应尽量缩短插管时间，以减少气管导管内壁细菌BF形成，改善气管插管患者的预后。
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图1 气管导管内表面细菌(金黄色葡萄球菌)BF的SEM图 图2 气管导管内表面细菌(铜绿假单胞菌)BF的SEM图 图3 气管导管内表面(对照组)SEM图 图4 气管导管内表面细菌(金黄色葡萄球菌)BF的图 图5 气管导管内表面细菌(铜绿假单胞菌)BF的TEM图 图3 气管导管内表面不定型基质物TEM图
作者单位：柏宏坚200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
何礼贤200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
瞿介明200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
胡必杰200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
, 百拇医药
王葆青200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
陈雪华200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
潘珏200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
董荔(200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
参考文献
[1]Koerner RJ. Contribution of endotracheal tubes to the pathogenesis of ventilator-associated pneumonia. J Hosp Infect , 1997, 35: 83-89.
, 百拇医药
[2]Rello J, Sonora R, Jubert P , et al. Pneumonia in intubated patients: role of respiratory airway care. Am J Respir Crit Care Med , 1996, 154:111-115.
[3]Cash HA, Woods DE, McCullough B, et al. A rat model of chronic respiratory infection with pseudomonas aeruginosa. Am Rev Respir Dis , 1979,119:453-459.
[4]Bowden GH, Li YH. Nutritional influences on biofilm development. Adv Dent Res, 1997,11:81-99.
[5]Inglis TJJ, Millar MR, Jones JG, et al. Tracheal tube biofilms as source of bacterial colonization of the long. J Clin Microbial , 1989,27:2014-2018., 百拇医药
柏宏坚 何礼贤 瞿介明 胡必杰 王葆青 陈雪华 潘珏 董荔
摘 要 目的 观察气管导管内表面细菌生物被膜(BF)形成情况并初步探讨其在呼吸机相关性肺炎(VAP)发生中的作用。方法 用扫描电子显微镜和透射电子显微镜分别观察拔出的气管导管内表面，同时作下呼吸道和导管内壁细菌学检测。结果 76%(19/25)气管导管内壁覆盖不定型基质物，其平均插管时间[(10.7±7.9)天]，长于无不定型基质物覆盖的导管的插管时间[(2.1±0.8)天](P<0.05)；78%(14/18) 不定型基质物中含大量球菌或杆菌；导管内壁含致病菌的16例中，11例在插管期间即从下呼吸道分泌物中分离得到相同菌株；在7/8 VAP患者中，VAP病原体与导管内分离的病原体相同。结论 气管导管内细菌BF形成与插管时间密切相关，导管内细菌BF的存在可能与VAP病原体有一定相关性。
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关键词：生物膜；气管导管；电子显微镜；呼吸机相关性肺炎
呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia, VAP)是机械通气患者的严重并发症，其发生率和病死率较高，病情易反复，抗生素治疗效果较差，类似于细菌生物被膜(biofilm, BF)相关性感染。气管插管是VAP最主要的易患因素[1]，但关于其在VAP发病中作用机制研究较少。本研究使用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)和透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察气管导管内表面细菌BF形成情况并探讨其在VAP发病中的作用。
对象与方法
一、对象
25例患者(外科ICU 23例、呼吸ICU 2例)，男性21例、女性4例，平均年龄(48.4±13.4)岁(26～72岁)。术后患者19例、外伤患者4例、哮喘和脑出血患者各1例。平均插管时间(8.6±6.1)天(1～27天)，其中23例在气管插管期间使用了2种或2种以上抗生素。本组病例中8例(8/25) 在拔管前发生VAP，发病前平均插管(9.9±4.6)天。
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二、材料
1.培养基和试剂：M-H琼脂平板，巧克力平板，PBS缓冲液(pH 7.4)，2.5%戊二醛，1%锇酸，系列酒精，醋酸正戊酯，丙酮，醋酸铀，枸橼酸铅，618环氧树脂包埋液。
2.器材：PVC高容低压气囊气管导管，超薄切片机，CO2临界点干燥仪(HCP-2型)，离子溅射仪，透射电镜(JEM-1200EX)，扫描电镜(日立S-520型)。
三、方法
1.气管导管标本收集：1998年7月～1999年5月收集上海医科大学附属中山医院外科ICU和呼吸ICU住院患者拔出的气管导管(除外插管前肺部感染) (插管时间≥24 h)。用无菌生理盐水冲洗导管外壁和内壁，截取气管导管下端长2 cm导管标本，作采样接种。再截取邻近气管导管2 cm放置2.5%戊二醛溶液中固定。取2根气管导管(未用)作同样的处理为对照组。
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2.细菌学检测：无菌吸痰管从下呼吸道吸取的标本和棉签蘸取气管导管内表面获得标本，分别接种在MH琼脂平板和巧克力平板，35°C培养18～24 h。所有细菌使用IMS细菌鉴定药敏分析系统鉴定。
3.SEM标本制备：将气管导管标本先用戊二醛和锇酸双重固定，系列酒精脱水，醋酸正戊酯置换，CO2临界点干燥，离子溅射仪喷金，然后用扫描电镜观察、拍照。
4.TEM标本制备：用戊二醛固定标本2小时，无菌刀片刮取气管导管内表面物质，磷酸缓冲液漂洗，锇酸固定2小时，梯度酒精、丙酮脱水，618环氧树脂包埋液浸透包埋，切片厚度60～80 nm；醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜观察、拍照。
四、有关定义和标准
1.VAP的诊断标准：参照文献[2]。
, 百拇医药 2.呼吸道正常菌群：指草绿色链球菌、类白喉杆菌和非致病奈瑟菌。
结果
一、细菌学检测结果
25例气管导管内壁作细菌学采样，9例[平均插管时间(3.8±2.1)天]为无菌生长(3例)或正常菌群(6例)；另16例[平均插管时间(12.8±7.1)天]分离得到的细菌包括肠杆菌科细菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌等，其中11例(11/16)在拔管前从患者下呼吸道的吸引物中分离得到同种细菌。在8例VAP患者中，细菌学检测和SEM、TEM检测发现所有气管导管表面有细菌存在。7例(7/8)导管分离的细菌与VAP的病原体相同。VAP病原菌包括铜绿假单胞菌和不动杆菌各2例、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎球菌各1例。
二、SEM观察结果
, http://www.100md.com SEM显示76%(19/25)气管导管[平均插管时间(10.7±7.9)天]内表面覆盖融合的不定型基质物，其中16例(16/19)不定型基质物下，见到明显的杆状或球状细菌轮廓(图1，2)。另6例(6/25)[平均插管时间(2.1±0.8)天]未见或仅见少量小片状不定型基质物。2例对照组气管导管内表面无不定型基质物覆盖(图3)。这种不定型基质物是细菌BF的胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)或呼吸道分泌物粘多糖，在制作电镜标本时脱水浓缩后的产物。
三、TEM观察结果
18例(18/25)气管导管内表面获取了足够标本，用于制成TEM观察切片。在14例(14/18)切片中，基质物(BF中EPS或呼吸道分泌的粘多糖)包裹大量杆菌或球菌，细菌约1～2 μm(图4，5)。另4例(4/18)标本中仅见大量基质物，而无或偶见细菌，这可能是呼吸道分泌的粘多糖成分(图6)。SEM观察到的气管导管内表面的不定型基质物并不都是细菌BF，部分可能是呼吸道分泌的粘多糖。因此，可以认为本组病例中，14例(14/25)气管导管内表面有细菌BF的存在。
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讨论
近年来，一些研究证实发生感染的人工关节、导尿管、心脏人工瓣膜、静脉导管及各种体液引流管等表面大多有细菌BF的存在。如其它植入装置一样，由PVC材料制成的气管导管，细菌易在其表面粘附增殖，大量分泌EPS形成细菌BF。气管导管表面的细菌大多来源于口咽部或胃肠定植菌和外界病原体的直接接种。本组病例中，SEM和TEM观察发现14例(14/25)气管导管内表面有细菌BF的存在。气管导管内的气体和液体流动，吸痰时吸痰管机械碰撞可导致细菌BF移动、堆积或脱落，易使这种含有大量细菌的BF碎片脱落进入下呼吸道。文献报道聚集或粘附的细菌较相同数量分散细菌更易引起下呼吸道感染或肺炎[3]。因此这些含有大量相互聚集及粘附细菌的细菌BF碎片进入下呼吸道就更易引起其感染。在8例VAP中，7/8病原体与气管导管内菌株相同，提示气管导管内的细菌BF存在可能与VAP病原体之间存在一定相关性。
导管内壁有细菌存在的16例中，有5例在拔管前其下呼吸道内吸出物未发现相同细菌，这可能是由于全身使用的抗生素杀灭下呼吸道内细菌。抗生素因其难以到达气管导管内壁以及细菌BF的存在，因而难以杀灭气管导管内细菌。提示在抗生素杀灭肺部定植或感染的细菌以后，气管导管的细菌BF很可能成为肺部细菌再定植或感染的病原体重要来源，从而导致VAP病情反复和难以治愈。
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尽管在电镜观察下细菌BF的EPS与呼吸道分泌的粘多糖难以区分，但呼吸道分泌的粘多糖并不干扰细菌的定植或细菌BF的形成，这些粘多糖可作为细菌的营养物质，可有助于细菌BF形成[4]。因此，呼吸道分泌的粘多糖并不影响气管导管内细菌BF在VAP发病中的作用。TEM观察发现4例(4/18)标本中仅见大量的基质物，而无成群或大量的细菌，这些不含细菌的物质很可能是呼吸道所分泌的粘多糖。因此，将SEM和TEM观察结果进行综合分析，有助于提高电镜观察气管导管细菌BF的准确性和特异性。
SEM观察发现19例的气管导管内表面有基质物覆盖，其平均插管时间[(10.7±7.9)天]，显著长于无或少量不定型基质物覆盖的6例[平均插管时间(2.1±0.8)天](P<0.05)，提示气管导管内细菌BF形成与插管持续时间有关，此与文献报道一致[5]。因此，临床上应尽量缩短插管时间，以减少气管导管内壁细菌BF形成，改善气管插管患者的预后。
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图1 气管导管内表面细菌(金黄色葡萄球菌)BF的SEM图 图2 气管导管内表面细菌(铜绿假单胞菌)BF的SEM图 图3 气管导管内表面(对照组)SEM图 图4 气管导管内表面细菌(金黄色葡萄球菌)BF的图 图5 气管导管内表面细菌(铜绿假单胞菌)BF的TEM图 图3 气管导管内表面不定型基质物TEM图
作者单位：柏宏坚200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
何礼贤200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
瞿介明200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
胡必杰200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
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王葆青200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
陈雪华200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
潘珏200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
董荔(200032 上海医科大学中山医院呼吸病研究所 柏宏坚现在江苏省盐城市第一人民医院呼吸科，224001)
参考文献
[1]Koerner RJ. Contribution of endotracheal tubes to the pathogenesis of ventilator-associated pneumonia. J Hosp Infect , 1997, 35: 83-89.
, 百拇医药
[2]Rello J, Sonora R, Jubert P , et al. Pneumonia in intubated patients: role of respiratory airway care. Am J Respir Crit Care Med , 1996, 154:111-115.
[3]Cash HA, Woods DE, McCullough B, et al. A rat model of chronic respiratory infection with pseudomonas aeruginosa. Am Rev Respir Dis , 1979,119:453-459.
[4]Bowden GH, Li YH. Nutritional influences on biofilm development. Adv Dent Res, 1997,11:81-99.
[5]Inglis TJJ, Millar MR, Jones JG, et al. Tracheal tube biofilms as source of bacterial colonization of the long. J Clin Microbial , 1989,27:2014-2018., 百拇医药