滇川钉螺的同工酶谱比较*
作者：王少海 何立 康在彬
单位：王少海 湖北药检高等专科学校寄生虫学教研室(武汉，430064)；何 立 康在彬 湖北医科大学寄生虫学教研室
关键词：钉螺；苹果酸脱氢酶；酯酶；同工酶；分类
中国人兽共患病杂志990119 摘 要 目的 研究滇川工地钉螺的同工酶谱特征及其亲缘关系，为钉螺分类提供资料。方法 对采自四川省天全、绵竹、彭县；云南省大理、楚雄、洱源的钉螺分别进行解剖、匀浆，应用聚丙烯酰胺凝胶对匀浆物电泳，分别进行苹果酸脱氢酶(MDH)和酯酶同工酶(EST)染色。结果 MDH共分离出3条酶带，6地钉螺酶谱特征完全一致，Rf值为0.164，0.208，0.309，EST共分离出11～14条酶带，6地钉螺完全一致的酶带有8条，Rf值为0.074，0.296，0.373，0.408，0.497，0.520，0.601，0.651。结论 2省间曾被命名为不同种群的钉螺亲缘关系密切；同时因长期的地理阻隔，各隔离群钉螺酶谱特征已出现不同程度的分化。
, 百拇医药
COMPARATIVE STUDY ON THE ISOENZYME PATTERNS OF
ONCOMELANIA SNAILS IN SICHUAN AND YUNNAN PROVINCES
Wang Shaohai He Li Kang Zaibin
(Hubei College of Pharmacy and Medical Laboratory Technology,Wuhan,430064)
ABSTRACT Aim To study isoenzyme patterns and relationship of Oncomelania snials between Sichuan and Yunnan Provinces.Methods The snails were collected from Tianquan,Mianzhu,Pengxian counties of Sichuan Province,Dali,Chuxiong,Eryuan counties of Yunnan Province.All these snails were electrophoresed by means of slab polyacrylamide gel,then were stained on malate dehydrogenase(MDH)isoenzyme and esterase(EST).Results 3 enzyme bands were separated on MDH from snails of 6 counties and their enzyme patterns were entirely identical,Rf values were 0.164，0.208，0.309.11～14 enzyme bands were entirely identical,Rf values were 0.074，0.0296，0.373，0.408，0.497，0.520，0.601，0.651.Conclusion The snails population from the 2 provinces was very closely related,but still some differences existed in the characteristics of encyme patterns between snails of different regions because of long-period geographic isolation.
, 百拇医药
KEY WORDS Oncomelania Malate dehydrogenase Esterase Isoenzyme Classification
1946年，美国贝类学家Bartsch根据Robertson采自云南大理的钉螺标本和姚永政采自四川彭县的钉螺标本，分别命名为新种Schistosomophra robertsoni和S.slateri〔1〕，2种钉螺均属外壳光滑，无唇嵴的光壳钉螺，形态特征极为相似，唯一区别是S.robertsoni壳形比S.slateri细长。解放后，通过对上述2省血吸虫病及钉螺分布的调查，相继在云南省18个县市和四川省55个县市发现有钉螺分布。国内学者对它们的形态，生态、感染性等方面都进行了深入的研究，并依据形态特征，认为应将上述2种合并为1种(Oncomelania robertsoni)〔2〕或一亚种(O.hupensis robertsoni)〔3〕，观点存在分歧。随着蛋白质电泳技术的广泛应用，为物种分类及亲缘关系鉴别又提供了新的研究手段。滇川2省钉螺亲缘关系如何，是否存在基因水平的分化，尚缺乏足够的证据，为了给钉螺分类的深入研究提供更加全面的资料，本文对上述2省钉螺进行同工酶电泳酶谱比较，现将结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料来源 钉螺分别采自四川省天全、绵竹、彭县；云南省大理、楚雄、洱源，上述6地钉螺均在本实验室用同一饲料短期饲养，然后用于实验。
1.2 实验方法
1.2.1 材料制备 从各地钉螺中选取发育成熟，无寄生虫感染的钉螺，解剖出钉螺软体并经蒸馏水漂洗片刻，滤纸吸干多余水分，然后按5μl/mg加双蒸水，在冰浴中充分匀浆，经10000r/min离心30min，上清液用于点样。
1.2.2 电泳方法 应用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳技术，浓缩胶及分离胶浓度分别为3.0%pH6.7和7.5%(MDH同工酶为5%)pH8.9，凝胶大小为120mm×100mm×1.5mm，电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲系统(pH8.3)，电泳在循环水冷却条件下进行。起始电泳每板15mA，样本进入分离胶后，调整电流至每板30mA，待溴酚蓝示踪染料迁移至距离胶底1cm处终止电泳。
, 百拇医药
1.2.3 染色方法 分别采用苹果酸脱氢酶(MDH)和酯酶同工酶(EST)两种方法染色，将电泳后的凝胶轻放入新鲜配制的染色液中，37℃孵育1h，漂洗后观察，摄片并记录结果，然后保存于7%的冰乙酸中。
苹果酸脱氢酶染色液配制 1mol/L苹果酸钠2ml，0.1mol/L迭氮钠1ml，0.05mol/L氯化镁1ml，0.5%DPN(辅酶Ⅰ)1ml，0.1%吩嗪二甲酯硫酸盐0.25ml，0.1%噻唑蓝2.5ml，0.2mol/L Tris-HCl pH7.4 2.5ml。
酯酶染色液配制 醋酸-α-萘酯40mg，坚固蓝RR40mg，丙酮2ml，1%MgCl2 1ml，加0.2mol/L Tris-HCl pH7.4至100ml。
所用染色试剂均为国产分析纯产品。
2 结 果
, 百拇医药
各地钉螺每次均同板电泳，结果显示迁移率稳定，重复性好。
2.1 MDH同工酶 6地钉螺均显示完全一致的同工酶谱(图1)，从阴极至阳极端依次为MDH1～3，其中MDH1、3为活性较强的优势酶带，电泳迁移率各地均为0.164和0.309，MDH2为活性较弱的酶带，Rf值为0.208。
2.2 EST同工酶 6地钉螺共分离出14条酶带，从阴极至阳极端依次为EST1-14(图2)，其中四川3地钉螺共有13～14条酶带，云南3地钉螺共有11～12条酶带，各地钉螺酶带的电泳迁移率见表1。四川3地除彭县钉螺多1条ESP101Rf值为0.466外，其它酶谱特征基本一致，仅个别酶带活性稍有差异；云南3地钉螺除大理，楚雄分别缺EST4和EST8外，其它酶谱特征则完全一致。6地钉螺电泳迁移率完全一致的酶带有8条，它们的Rf值分别0.074，0.296，0.373，0.408，0.497，0.520，0.601，0.651。四川钉螺独有的弱带有2条，Rf值为0.025(1条极纤细的弱带)0.278；云南钉螺独有的酶带有1条，Rf值为0.343。
, 百拇医药
图1
6地钉螺MDH同工酶电泳酶谱
A.洱源 B.楚雄 C.大理 D.绵竹 E.彭县 F.天全
Fig 1 Electrophoretic pattern of malate dehydrogenase isoenzyme
A.Eryuan B.Chuxiong C.Dali D.Mianzhu E.Pengxian F.Tianquan
图2
6地钉螺EST同工酶电泳酶谱
Fig 2 Electrophoretic pattern of esterase isoenzyme
, 百拇医药
表16地钉螺酯酶同工酶的Rf值
Table 1 Rf values of esterase isoenzyme of Oncomelania snails 云南Yunnan
四川Sichuan
洱源
Eryuan
楚雄
Chuxiong
大理
Dali
绵竹
Mianzhu
, http://www.100md.com
彭县
Pengxian
天全
Tianquan
0.074
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0.025
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0.239
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0.074
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0.296
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0.224
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0.322
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0.343
0.278
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0.373
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3 讨 论
Bartsch依据形态及齿舌特征，曾在上述2省报道过2个种，刘月英等〔3〕根据2省5地钉螺的壳型指数分布频率曲线认为S.slateri应为S.robertsoni的异名，并将其降为亚种(Oncomelania hupensis robertsoni)，对此国内学者曾有不同看法〔4〕但仅是分类级次上的观点分歧。按照钉螺固有的形态特征，前人也均认为它们应同属一个类群。
由于中国大陆钉螺分布范围广，形态变异大，单靠传统的分类方法，已难以作出准确的判断。近年来，国内外不少学者都利用同工酶电泳技术，对钉螺的等位基因，遗传变异等进行研究，为钉螺分类提供了较好的参考资料。Woodruff等〔5、6〕通过对钉螺同工酶的研究，认为菲律宾4岛的钉螺种群间差异较小，而与中国贵池钉螺和安徽钉螺差异较大，属不同的种群。孙乐平等〔7〕通过对钉螺的等位基因位点的研究，认为中国大陆钉螺既存在一定的亲缘关系，又因环境和地域不同，基因水平发生了变异。
, 百拇医药
本文通过对滇川2省钉螺同工酶的研究结果可见，在苹果酸脱氢酶方面，从酶带数目，电泳迁移率和酶带活性均表现出完全相同的酶谱特征；在酯酶同工酶方面，2省间钉螺电泳迁移率完全一致的酶带有8条，提示6地钉螺间也具有较大的相似性。同工酶是基因的表达产物，它的性质差异直接反应基因的类型和分化程度。从上述两省钉螺的酶谱特征，结合6地钉螺形态基本一致，生态环境相似，提示它们在进化上高度同源，亲缘关系密切。同时，四川3地与云南3地钉螺酶谱间也存在一些轻微的差异，而且这种差异程度明显地较本省内不同地区间的差异程度要大，与前人依据形态特征研究的结果相一致。周晓农等〔8〕认为，各隔离群湖北钉螺基因水平上的差异程度，与隔离群间的距离关系密切，距离远则变异大，距离近则变异小。从地理分布上可见，滇川2省均同属山区，各地钉螺间存在着长期，不同程度的地理阻隔。隔离群间转移扩散机会减少，可能是造成各钉螺群体间同工酶谱特征出现差异的主要因素。
*国家自然科学基金资助项目
, 百拇医药 4 参考文献
1.Bartsch P.Schistosomophara in China,with descriptions of two new species and a note on their philippine relative.Smithsonian Misc Coll,1946,104(20):1.
2.康在彬.一种与多种之争(钉螺分类问题的商榷).湖北医学院学报，1987，8：1.
3.刘月英，楼子康，王耀先，等.钉螺的亚种分化.动物分类学报，1981，6：253.
4.Zai-binkang.Comments on some probleme of taxonomy of Oncomelania.Jpn J Parasitol,1985,34(2):53.
, 百拇医药
5.Woodruff DS,Carpenter MP,Upathan ES,et al.Genetic studies of medically important snails in southeast Asia.Isoenzyme Bulletin,1986,19:32.
6.Woodruff DS,Staub Kc,Upathan ES,et al.Genetic variation in Oncomelania hupensis:Schistosoma japonicm transmitting snalis in china and the philippines are distinct species.Malacologia,1988,29:347.
7.孙乐平，周晓农，洪青标，等.中国大陆钉螺种群遗传学研究Ⅳ钉螺等位基因酶谱.中国血吸虫病防治杂志，1996，8：339.
8.周晓农，孙乐平，徐秋，等.中国大陆不同地域隔离群湖北钉螺基因组DNA的限制酶切长度差异.中国血吸虫病防治杂志，1994，6：196.
1998年2月4日收稿 1998年8月13日修回, http://www.100md.com
单位：王少海 湖北药检高等专科学校寄生虫学教研室(武汉，430064)；何 立 康在彬 湖北医科大学寄生虫学教研室
关键词：钉螺；苹果酸脱氢酶；酯酶；同工酶；分类
中国人兽共患病杂志990119 摘 要 目的 研究滇川工地钉螺的同工酶谱特征及其亲缘关系，为钉螺分类提供资料。方法 对采自四川省天全、绵竹、彭县；云南省大理、楚雄、洱源的钉螺分别进行解剖、匀浆，应用聚丙烯酰胺凝胶对匀浆物电泳，分别进行苹果酸脱氢酶(MDH)和酯酶同工酶(EST)染色。结果 MDH共分离出3条酶带，6地钉螺酶谱特征完全一致，Rf值为0.164，0.208，0.309，EST共分离出11～14条酶带，6地钉螺完全一致的酶带有8条，Rf值为0.074，0.296，0.373，0.408，0.497，0.520，0.601，0.651。结论 2省间曾被命名为不同种群的钉螺亲缘关系密切；同时因长期的地理阻隔，各隔离群钉螺酶谱特征已出现不同程度的分化。
, 百拇医药
COMPARATIVE STUDY ON THE ISOENZYME PATTERNS OF
ONCOMELANIA SNAILS IN SICHUAN AND YUNNAN PROVINCES
Wang Shaohai He Li Kang Zaibin
(Hubei College of Pharmacy and Medical Laboratory Technology,Wuhan,430064)
ABSTRACT Aim To study isoenzyme patterns and relationship of Oncomelania snials between Sichuan and Yunnan Provinces.Methods The snails were collected from Tianquan,Mianzhu,Pengxian counties of Sichuan Province,Dali,Chuxiong,Eryuan counties of Yunnan Province.All these snails were electrophoresed by means of slab polyacrylamide gel,then were stained on malate dehydrogenase(MDH)isoenzyme and esterase(EST).Results 3 enzyme bands were separated on MDH from snails of 6 counties and their enzyme patterns were entirely identical,Rf values were 0.164，0.208，0.309.11～14 enzyme bands were entirely identical,Rf values were 0.074，0.0296，0.373，0.408，0.497，0.520，0.601，0.651.Conclusion The snails population from the 2 provinces was very closely related,but still some differences existed in the characteristics of encyme patterns between snails of different regions because of long-period geographic isolation.
, 百拇医药
KEY WORDS Oncomelania Malate dehydrogenase Esterase Isoenzyme Classification
1946年，美国贝类学家Bartsch根据Robertson采自云南大理的钉螺标本和姚永政采自四川彭县的钉螺标本，分别命名为新种Schistosomophra robertsoni和S.slateri〔1〕，2种钉螺均属外壳光滑，无唇嵴的光壳钉螺，形态特征极为相似，唯一区别是S.robertsoni壳形比S.slateri细长。解放后，通过对上述2省血吸虫病及钉螺分布的调查，相继在云南省18个县市和四川省55个县市发现有钉螺分布。国内学者对它们的形态，生态、感染性等方面都进行了深入的研究，并依据形态特征，认为应将上述2种合并为1种(Oncomelania robertsoni)〔2〕或一亚种(O.hupensis robertsoni)〔3〕，观点存在分歧。随着蛋白质电泳技术的广泛应用，为物种分类及亲缘关系鉴别又提供了新的研究手段。滇川2省钉螺亲缘关系如何，是否存在基因水平的分化，尚缺乏足够的证据，为了给钉螺分类的深入研究提供更加全面的资料，本文对上述2省钉螺进行同工酶电泳酶谱比较，现将结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料来源 钉螺分别采自四川省天全、绵竹、彭县；云南省大理、楚雄、洱源，上述6地钉螺均在本实验室用同一饲料短期饲养，然后用于实验。
1.2 实验方法
1.2.1 材料制备 从各地钉螺中选取发育成熟，无寄生虫感染的钉螺，解剖出钉螺软体并经蒸馏水漂洗片刻，滤纸吸干多余水分，然后按5μl/mg加双蒸水，在冰浴中充分匀浆，经10000r/min离心30min，上清液用于点样。
1.2.2 电泳方法 应用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳技术，浓缩胶及分离胶浓度分别为3.0%pH6.7和7.5%(MDH同工酶为5%)pH8.9，凝胶大小为120mm×100mm×1.5mm，电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲系统(pH8.3)，电泳在循环水冷却条件下进行。起始电泳每板15mA，样本进入分离胶后，调整电流至每板30mA，待溴酚蓝示踪染料迁移至距离胶底1cm处终止电泳。
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1.2.3 染色方法 分别采用苹果酸脱氢酶(MDH)和酯酶同工酶(EST)两种方法染色，将电泳后的凝胶轻放入新鲜配制的染色液中，37℃孵育1h，漂洗后观察，摄片并记录结果，然后保存于7%的冰乙酸中。
苹果酸脱氢酶染色液配制 1mol/L苹果酸钠2ml，0.1mol/L迭氮钠1ml，0.05mol/L氯化镁1ml，0.5%DPN(辅酶Ⅰ)1ml，0.1%吩嗪二甲酯硫酸盐0.25ml，0.1%噻唑蓝2.5ml，0.2mol/L Tris-HCl pH7.4 2.5ml。
酯酶染色液配制 醋酸-α-萘酯40mg，坚固蓝RR40mg，丙酮2ml，1%MgCl2 1ml，加0.2mol/L Tris-HCl pH7.4至100ml。
所用染色试剂均为国产分析纯产品。
2 结 果
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各地钉螺每次均同板电泳，结果显示迁移率稳定，重复性好。
2.1 MDH同工酶 6地钉螺均显示完全一致的同工酶谱(图1)，从阴极至阳极端依次为MDH1～3，其中MDH1、3为活性较强的优势酶带，电泳迁移率各地均为0.164和0.309，MDH2为活性较弱的酶带，Rf值为0.208。
2.2 EST同工酶 6地钉螺共分离出14条酶带，从阴极至阳极端依次为EST1-14(图2)，其中四川3地钉螺共有13～14条酶带，云南3地钉螺共有11～12条酶带，各地钉螺酶带的电泳迁移率见表1。四川3地除彭县钉螺多1条ESP101Rf值为0.466外，其它酶谱特征基本一致，仅个别酶带活性稍有差异；云南3地钉螺除大理，楚雄分别缺EST4和EST8外，其它酶谱特征则完全一致。6地钉螺电泳迁移率完全一致的酶带有8条，它们的Rf值分别0.074，0.296，0.373，0.408，0.497，0.520，0.601，0.651。四川钉螺独有的弱带有2条，Rf值为0.025(1条极纤细的弱带)0.278；云南钉螺独有的酶带有1条，Rf值为0.343。
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图1
6地钉螺MDH同工酶电泳酶谱
A.洱源 B.楚雄 C.大理 D.绵竹 E.彭县 F.天全
Fig 1 Electrophoretic pattern of malate dehydrogenase isoenzyme
A.Eryuan B.Chuxiong C.Dali D.Mianzhu E.Pengxian F.Tianquan
图2
6地钉螺EST同工酶电泳酶谱
Fig 2 Electrophoretic pattern of esterase isoenzyme
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表16地钉螺酯酶同工酶的Rf值
Table 1 Rf values of esterase isoenzyme of Oncomelania snails 云南Yunnan
四川Sichuan
洱源
Eryuan
楚雄
Chuxiong
大理
Dali
绵竹
Mianzhu
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彭县
Pengxian
天全
Tianquan
0.074
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3 讨 论
Bartsch依据形态及齿舌特征，曾在上述2省报道过2个种，刘月英等〔3〕根据2省5地钉螺的壳型指数分布频率曲线认为S.slateri应为S.robertsoni的异名，并将其降为亚种(Oncomelania hupensis robertsoni)，对此国内学者曾有不同看法〔4〕但仅是分类级次上的观点分歧。按照钉螺固有的形态特征，前人也均认为它们应同属一个类群。
由于中国大陆钉螺分布范围广，形态变异大，单靠传统的分类方法，已难以作出准确的判断。近年来，国内外不少学者都利用同工酶电泳技术，对钉螺的等位基因，遗传变异等进行研究，为钉螺分类提供了较好的参考资料。Woodruff等〔5、6〕通过对钉螺同工酶的研究，认为菲律宾4岛的钉螺种群间差异较小，而与中国贵池钉螺和安徽钉螺差异较大，属不同的种群。孙乐平等〔7〕通过对钉螺的等位基因位点的研究，认为中国大陆钉螺既存在一定的亲缘关系，又因环境和地域不同，基因水平发生了变异。
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本文通过对滇川2省钉螺同工酶的研究结果可见，在苹果酸脱氢酶方面，从酶带数目，电泳迁移率和酶带活性均表现出完全相同的酶谱特征；在酯酶同工酶方面，2省间钉螺电泳迁移率完全一致的酶带有8条，提示6地钉螺间也具有较大的相似性。同工酶是基因的表达产物，它的性质差异直接反应基因的类型和分化程度。从上述两省钉螺的酶谱特征，结合6地钉螺形态基本一致，生态环境相似，提示它们在进化上高度同源，亲缘关系密切。同时，四川3地与云南3地钉螺酶谱间也存在一些轻微的差异，而且这种差异程度明显地较本省内不同地区间的差异程度要大，与前人依据形态特征研究的结果相一致。周晓农等〔8〕认为，各隔离群湖北钉螺基因水平上的差异程度，与隔离群间的距离关系密切，距离远则变异大，距离近则变异小。从地理分布上可见，滇川2省均同属山区，各地钉螺间存在着长期，不同程度的地理阻隔。隔离群间转移扩散机会减少，可能是造成各钉螺群体间同工酶谱特征出现差异的主要因素。
*国家自然科学基金资助项目
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1.Bartsch P.Schistosomophara in China,with descriptions of two new species and a note on their philippine relative.Smithsonian Misc Coll,1946,104(20):1.
2.康在彬.一种与多种之争(钉螺分类问题的商榷).湖北医学院学报，1987，8：1.
3.刘月英，楼子康，王耀先，等.钉螺的亚种分化.动物分类学报，1981，6：253.
4.Zai-binkang.Comments on some probleme of taxonomy of Oncomelania.Jpn J Parasitol,1985,34(2):53.
, 百拇医药
5.Woodruff DS,Carpenter MP,Upathan ES,et al.Genetic studies of medically important snails in southeast Asia.Isoenzyme Bulletin,1986,19:32.
6.Woodruff DS,Staub Kc,Upathan ES,et al.Genetic variation in Oncomelania hupensis:Schistosoma japonicm transmitting snalis in china and the philippines are distinct species.Malacologia,1988,29:347.
7.孙乐平，周晓农，洪青标，等.中国大陆钉螺种群遗传学研究Ⅳ钉螺等位基因酶谱.中国血吸虫病防治杂志，1996，8：339.
8.周晓农，孙乐平，徐秋，等.中国大陆不同地域隔离群湖北钉螺基因组DNA的限制酶切长度差异.中国血吸虫病防治杂志，1994，6：196.
1998年2月4日收稿 1998年8月13日修回, http://www.100md.com