第六节 诊断
一、诊断依据：
(一) 流行病学及临床表现
(二) 实验室检查
(1)主要是中度以上细胞免疫缺陷包括：CD4+T 淋巴细胞耗竭：T淋巴细胞功能下降，外周血淋巴细胞显著减少，CD4<200/μl，CD4/CD8<1.0，(正常人为1.25～2.1)，迟发型变态反应皮试阴性，有丝分裂原刺激反应低下。
(2)B淋巴细胞功能失调：多克隆性高球蛋白血症，循环免疫复合物形成和自身抗体形成。
(3)NK细胞活性下降
(4)各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤，如KS；
(三)HIV抗体检测
1.酶联免疫吸附法(ELISA)；2.明胶颗粒凝集试验(PA)；3.免疫荧光检测法(IFA)；4.免疫印迹检测法(Western Blot，简称WB法)；5.放射免疫沉淀法(RIP)。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV病毒。
(四)PCR技术检测HIV病毒
1.标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20～-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖(Ficoll)离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。
可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞(PMC)：
① 取4ml血液用Hanks液1：1稀释。
② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。
③ 2500r/min离心20min。
④ 吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。
⑤ 加入RPMI-1640生长液(10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/ml polyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P),使细胞浓度为2×106/ml。
⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的靶细胞。
2.模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。
(1)从外周血单核细胞中提取DNA
方法A：
①取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。
②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。
③2500r/min离心10min，弃上清。
④沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A(100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3)中，使细胞浓度为6×106/ml。
⑤加入等体积的溶液B(10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/L MgCl2，10%Tween20，10%NP-40)。
⑥ 于37℃保湿后置冰箱保存。
该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。
方法B：
①取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。
②2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，上清液可作血清学研究用。
③用10ml0.9%NaCl(含50%葡萄糖)将沉淀的细胞洗一次。
④再用10ml 0.9%NaCl(含50%葡萄糖)洗两次。
⑤通过聚蔗糖-400离心，分离单核细胞。
⑥将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液(10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K)中使细胞裂解。
⑦用酚一氯仿抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。
⑧加入3倍体积的无水乙醇，于-20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。
该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。
(2)从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录
方法A：
① 5ml血液标本，通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。
② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。
③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。
④ 把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液(0.4mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40)中,使细胞浓度为104/ml。
⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。
⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置-80℃保存，备用。
在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如(7)～(9)。
⑦ 取10μlRNA样品加2.7U DNase I。
⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。
⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNase A(15μg/份)，37℃保温10min，置-20℃保存。
方法B：
①取5ml新鲜血浆置一支离心管内。
②40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。
③将沉淀物溶于变性液(4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5 sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇)中充分混匀.
④加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.
⑤13000r/min离心20min.
⑥轻轻将水相转移到一支新管中.
⑦加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右.
⑧13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀.
⑨沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥.
⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录.
⑾ 取10μl RNA样品.
⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH 8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHD QLP GX PUH R XHH TR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。
⒀ 42℃保温30～60min,然后93℃5min.
⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。
由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。
三、PCR扩增步骤
(一)引物的设计与合成
HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式-PCR方法，来提高检测的灵敏性。
检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。
已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。
表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及探针
| 一、 支持疗法、尽可能改善AIDS患者的进行性消耗。
二、 免疫调节剂治疗： (一)白细胞介素2(IL-2)：提高机体对HIV感染细胞的MHC限制的细胞毒性作用，亦提高非MHC限制的自然杀伤细胞(NK)及淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的活性。 (二)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)：增加循环中性粒细胞，提高机体的抗感染能力。 (三)灵杆菌素：激活脑下垂体——肾上腺皮质系统，调整机体内部环境与功能，增强机体对外界环境变化的适应能力，刺激机体产生体液抗体，使白细胞总数增加，吞噬功能加强，激活机体防御系统抗御病原微生物及病毒的侵袭。 (四)干扰素(IFN)：α-干扰素(IFN-α)，对部分病人可略提高CD4+T细胞，40%Kaposis肉瘤患者有瘤体消退；②β-干扰素(IFN-β)：静脉给药效果与IFN-α类似，但皮下注射，抗Kaposis肉瘤作用较弱；③γ-干扰素(IFN-γ)提高单核细胞—巨噬细胞活性，抗弓形体等条件性感染可能有一定效果。 三、 抗病毒制剂： (一) 抑制HIV与宿主细胞结合及穿入的药物：可溶性rsCD4能与HIV结合，占据CD4结合部位，使HIVgp120不能与CD4T淋巴细胞上的CD4结合，不能穿入感染CD4T淋巴细胞。 剂量：rsCD4临床试验30mg/日，肌注或静注，连续28天。 (二) 抑制HIV逆转录酶(RT)的药物：通过抑制逆转录酶，阻断HIV复制。效果较好的药物有：叠氮胸苷、双脱氧胞苷。
第十节 预防 一、 特异性预防 (一) 随着1993年美国CDC分类诊断标准，扩大了AIDS的诊断范围，有利于AIDS的预防及治疗，依据CD4T淋巴细胞减少，给予一定的投药。 (二) 艾滋病疫苗：美国对含有gp120成份的两种艾滋病疫苗进行了第二期296人的试验，由于已有6人发生了感染，而暂时终止。泰国正进行UBI合成疫苗试验。 (三) 阻断母婴传播：CD4+T 淋巴细胞>200/μl的艾滋病孕妇，用AIT于产前，产程内及婴儿治疗，有一定的保护效果。 二、 综合预防 (一) 普及宣传艾滋病的预防知识，了解传播途径和临床表现及预防方法； (二) 加强道德教育，禁止滥交，尤其与外籍人员性乱行为，取缔暗娼； (三) 避免与HIV感染者、艾滋病病人及高危人群发生性接触； (四) 禁止与静脉药隐者共用注射器、针头； (五) 使用进口血液，血液成份及血液制品时，必须进行HIV检测； (六) 国内供血者严格排选，应逐步做到检测HIV阴性方能供血，严防HIV传播； (七) 献血、献器官、组织及精液者应做HIV检测； (八) 建立艾滋病检测中心； (九) 提倡使用避孕套和避免肛交； (十) 艾滋病或HIV感染者应避免妊娠，出生婴儿应避免母乳喂养。 , http://www.100md.com |